白菜雄性不育基因的研究毕业论文(编辑修改稿)

白菜雄性不育基因的研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

蕊中 , 相应于小抱子单核初期时 , 可育株稍高于不育株 , 受精后迅速趋于一致 , 但整个变化幅度不大。 这一现象在小麦、玉米、高梁、洋葱 ,番茄 ,辣椒和水稻等植物中普遍存在 (Zhang 和 Croes,1983)。 王强等（ 20xx）采用化学杀雄剂以及增加脯氨酸的去雄剂对棉花花药氨基酸的影响，得出化学杀雄剂引起的氨基酸代谢失调可能是造成雄性不育的主要原因之一。 关其原因可能是植株受到胁迫后 , 光合作用减弱 ( 从叶绿 素含量降低可以说明 ) , 棉叶合成的 Pro 减少 , 并导致了输送到花药的 Pro 降低。 棉花植株遭受化学杀雄剂胁迫时 ,表现出来的生理反应还有矿质营养元素硼、锰、硫、铜、锌、镁、钙、铁等的吸收、运输受到影响。 大白菜为两性花异花传粉蔬菜作物，杂种优势十分显著。 由于其花器官小，单花结籽少，而单位面积的播种量又较大，常规的杂交制种必然存在去雄费工、费力、成本高等缺点。 雄性不育系的利用是配制大白菜杂交种经济、可靠的制种手段 (孙日飞， 20xx)。 已经获得的大白菜雄性不育材料，可以分成细胞核雄性 不育（ GMS）和细胞质雄性不育（ CMS）两种类型。 由于细胞核雄性不育材料的雄蕊退化一般比较彻底、不育性稳定、无不良性状伴生，倍受育种工作者的重视。 沈阳农业大学学士学位毕业论文 9 理想雄性不育系的不育株率应为 100%，经济性状具有较高的配合力。 100%不育株率的雄性不育材料最早是由本课题组于 1991 年在大白菜雄性不育“两用系”轮配试验中育成的，由于用传统的单基因隐性或显性遗传无法解释这种遗传现象，从而提出了“大白菜核基因雄性不育复等位基因遗传假说”（ Feng Hui et al., 1995），并为后来的实验所证实（ Feng Hui et al., 1996）。 目前本课题组已建立了一套该材料的应用技术体系，并实现了品种间和亚种间核不育复等位基因的交流，育成了多个新的具有 100%不育株率的雄性不育系 ,但对其产生雄性不育的分子基理还不清楚。 本课题组通过抑制差减杂交技术及 cDNAAFLP 方法已找到了一系列育性相关基因，但对于单个基因的功能及作用部位尚不清楚。 本研究即对大白菜育性相关 花粉囊专一性的脯氨酸富集蛋白 基因 BFAPG 的功能及时序表达作了相应研究，为探索复等位基因遗传的大白菜核雄性不育的机理奠定了基础。 1 材料和方法 1 材料和方法 实 验材料 本研究所用材料为本课题组转育的大白菜雄性不 育甲型两 用系 “AB01 ”，不育与可育材料除育性外背景相同，是研究差异基因分离的理想材料。 当甲型两用系植株现蕾开花后，分别取不育株和可育株花蕾进行研究。 实验方法 取样方法 植株现蕾开花后，分别取不育株和可育株花蕾进行研究。 我们按照花药在可育 、 不育花蕾中的发育变化情况 ， 初步 将花蕾 分为 6 个等级，即 1 级（花蕾长度＜ mm），稳定发育期； 2 级（花蕾长度： ～ 2mm），不育初期； 3 级（花蕾长度 : 2～ ）， 4级（花蕾长度 : ～ 3 mm）， 5 级（花蕾长度 : 3～ ）， 6 级（花蕾长度＞ mm） ， 分别选取开花期一致、其它性状相同的不育和可育材料的未开放花蕾按上述标准分别分为6 个等级。 另外对 56 级的大花蕾有分别取萼片、花瓣、雄蕊、雌蕊四份材料。 装入 管中，液氮速冻后， 85℃冰箱保存备用 装入 管中，液氮速冻后， 85℃冰箱保存备用。 RNA 提取 1 用具的处理、溶液配制及无 RNase 操作 ml PE 管 、 ml PCR 管、各种规格的枪头 用 %的 DEPC 溶液浸泡处理过夜，121℃ 高压灭菌 30 min。 用 % DEPC 水配 制 75 %乙 醇、 5 mol L1 NaAc，高压灭菌。 新的无水乙醇、氯仿、异丙醇。 RNA 提取过程、 cDNA 一 链合成均在无菌操作台上进行。 2 总 RNA 提取及质量检测分析 使 用 RNA simple Total RNA Kit（ TIANGEN 公司，离心柱型）进行总 RNA 提取 ，参照说明书，具体步骤如下： 取 样品，液氮研磨后迅速加入 1ml裂解液 RZ，漩涡 1min，室温放置 5min。 沈阳农业大学学士学位毕业论文 10 加入 200μl氯仿，剧烈震荡 15sec，室温放置 3 min。 4℃ 120xx rpm 离心 10 min，上层水相约 500μl转到新管。 缓慢加入 倍无水乙醇，混匀后转入吸附柱 CR3。 4℃ 120xx rpm离心 30 sec，弃废液。 向吸附柱 CR3 加入 500μl去蛋白液 RD， 4℃ 120xx rpm 离心30 sec，弃废液。 加入 700μl漂洗液 RW，室温静置 2 min， 4℃ 120xx rpm 离心 30 sec，弃废液。 加入 500μl漂洗液 RW，室温静置 2 min， 4℃ 120xx rpm 离心 30 sec，弃废液。 将吸附柱 CR3 放入 2 ml管中，加入 50μl RNasefree ddH2O，室温放置 2 min。 4℃ 120xx rpm离心 2 min。 重复 1011 操作，合并两次得到的溶液。 取 RNA 样品，加 1μl 6的 loading buffer 后于 %琼脂糖胶上电泳，电压 6Vcm1，电泳 1520 min 后，凝胶成像仪照相分析。 目的片段获得方法 将提取的 RNA采用 MicroFast Track 试剂盒 (Invitrogen)提供的试剂进行 mRNA的纯化，并按试剂盒推荐方法进行操作。 使用 PCR Select cDNA Subtraction Kit(Clontech)提 供的试剂进行抑制差减杂交，并根据试剂盒说明进行操作，分别将可育株为测试组及不育株为测试组的正向和 反向 SSH 的第二 次 PCR 产 物连接在载体 pGEMTeasy（ Promega） 上，并转化大肠杆 菌 JM109感 受态细胞，培养在含有 IPTG 和 XGal 的 LB氨 苄培养基上，挑选白色阳性克隆 于 96 微孔 板中，分别构成正向和反向消减 cDNA 文 库，挑取白色克隆 用通用测序引物 (M 13/pUC Sequencing primer,M13/pUC Reverse Sequencing primer)进行 PCR 检测。 选取 PCR 检测为阳性的克隆送 上海生工进行测序，测得序列去除载体和接头序列即获得目的片段。 RTPCR 以可育株与不育株花蕾为材料，重复三次，每重复为 10 棵植株的混合花蕾。 分别提取 RNA（方法同 ） , 并采用 MMLV (PROMEGER)合成第一链 cDNA (参照说明书进行 )。 第一链 cDNA 合成反应 见表 1： 表 1 第一链 cDNA 合成反应体系 组分 Components 反应体系 Reaction system Template RNA μg 51st Strand Synthesis Buffer μl dNTP Mixture μl RNase Inhibitor μl Oligo(dT)18 μl Reverse Transcriptase（ MMLV）（ 200 U/μl） μl RNaseFree ddH2O 定容 至 μl 沈阳农业大学学士学位毕业论文 11 表 2 RTPCR 中防御相关基因的引物及退火温度 Table2The primers and annealing temperature for defense related gene expression experiments 按照上述体系轻柔搅拌混匀各组分，室温放置 10 分钟后，移至 42℃ 恒温水浴槽内，反应 1 小时，反应结束后置于冰中冷却 2 分钟 线性扩增期确定 , 以不同浓度可育株 cDNA 为模板 , 检测内参基因 ACTIN 在不同循环数下产物量的差异 , 找出线性扩增期循环数作为半定量过程中的参照循环数。 RTPCR检测 , 根据目的基因片段序列利用 PRIMER5 及 DNAMAN设计目 的基因引物，提交 INVITROGEN 公司合成引物序列。 以不育花蕾和可育花蕾的第一链 cDNA 为模板 ,在线性扩增期进行半定量 PCR, 相关参数见表 2。 PCR 反应体系： 组分 Components 反应体系 Reaction system Template cDNA 5μl 10Buffer 3μl dNTP Mixture 引物 上游 1μl 引物 下 游 1μl UμL1 Taq 酶 RNaseFree ddH2O 定容 至 μl PCR 反应 程序： PCR 反应程序： 基因 引物 序列 (5’ → 3’) 产 物长度 /bp 退火温度 /℃ ACTIN F ATCTACGAGGGTTATGCT 412 54 R CCACTGAGGACGATGTTT BFAPG F CATCAAGCCCGACGACCT 412 58 R TGCGAATACTCCACCAAAT 沈阳农业大学学士学位毕业论文 12 将 PCR 反应所需的成分配置完后，在 PCR 仪上 94℃ 预加热 30 秒，使模板 DNA 充分变性，然后进入扩增循环。 在每一个循环中，先于 94℃ 保持 30 秒钟使模板变性，54℃ 退火 30 秒钟 ， 72℃ 延伸 30 秒， 完成一个循环。 重复这样的循环 27 次，使扩增的 DNA 片段大量累积。 最后，在 72℃ 保持 37min ，使产物延伸完整， 4℃ 保存。 94℃ 3min 94℃ 30s 54℃ 30S 30 个循环 72℃ 30s 72℃ 5min 全长序列的获得 利用 本课题组参与的“ 多国芸薹属植物基因组计划项目”中大白菜 Chiifu的利用 Chiifu BAC文库与基因组测序结果信息资源，以 片段 序列试图调取全长 cDNA序列 序列相似性搜索 利用 National Center for Biotechnology Information (NCBI)中的 BLAST 工具与 dbEST数据库，进行特异表达基因同源性比较和功能分析，根据查询序列（ Query）与比对序列（ Sbjct）共同跨越部分长度（ Alignment scores）、 Evalue 及同源相似性（ Identities）推测该特异表达基因的可能生物学功能。 2结果与分析 RNA 提取 我们将花蕾按照花药在可育不育花蕾中的发育变化情况初步分为 6 个等级，即 1 级（花蕾长度＜ mm），稳定发育期； 2 级（花蕾长度： ～ 2mm），不育初期； 3 级（花蕾长度 : 2～ ）， 4 级（花蕾长度 : ～ 3 mm）， 5 级（花蕾长度 : 3～ ）， 6 级（花蕾长度＞ mm） ， 分别选取开花期一致、其它性状相同的不育和可育材料的未开放花蕾按上述标准分别 分为 6个等级。 并分别提取 RNA， RNA提取采用 TIANGEN公司 RNA simple Total RNA Kit 进行，所提 RNA 质量合格，表现为 28S 与 18S 亮度接近 2： 1， OD260/OD280在 之间。 （如图 1） F1 F6 S1 S6 沈阳农业大学学士学位毕业论文 13 图 1 甲型两用系 ‘AB01’ 不同等级花蕾 RNA电泳图 F1F6 可育花蕾 6个级别； S1S6 不育花蕾 6个级别 肉桂酸转移酶基因 BFAPG 片段的获得 按照 Clontech 公司的 PCRSelectTM cDNA Subtraction Kit 说明书，经 抑制差减杂交及M13 通用引物 PCR 验证获得一片段大小约 600bp 的 条带 （图 2） ， 将该克隆送往上海生工进行测序，去除载体和接头序列后得到该片段的序列（图 3） ： 图 2 抑制差减文库获得 BFSKS 克隆的 PCR 检测结果 图 3 BFSKS 基因片段的测序结果 BFAPG 差异表达片段 RTPCR 验证 以 不育 花蕾 与可育花蕾 （均为不同等级大小的花蕾等量混合） 为材料 进行研究 , 采用 RTPCR方法调查了 BFAPG基因的表达差异变化。 结果发现 ,内标基因在所合成的不育及可育花蕾中均有相似表达，表明以 ACTIN基因作不育基因研究的内标基因是可靠的。 而目的基因 BFAPG仅在可育花蕾中有较高水平的表达，而在 不育花蕾中 几乎没有表达 , 条带用肉眼很难辨认 ，该基因为育性相关基因 （ 图 4)。 F S ACTIN 412bp BFAPG 376bp 1 G T AC CC G CC T A TCG CA G G TT G CG C CG C A TC AA G CC CG A CG AC CT T AA AA C 5 1 TG G CG TTTG T TTCG CA TCA G G TG G TTCA G G AA TTG AC CA T CT。