白刺液泡膜nah_逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆_与基因序列分析毕业论文(编辑修改稿)

白刺液泡膜nah_逆向转运蛋白及肌动蛋白基因的克隆_与基因序列分析毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

果 启动子区包含推测的 ABA 反应元件 (ABRE)，位于起始密码的736728 之间， ABRE 元件存在于不同物种对 ABA 应答的基因中。 由于 AtNHX1启动子的活性可被 NaCl、 KCl 和 ABA 上调 ,表明 AtNHX1 的表达受盐和 ABA 的上调是在转录水平上的调控。 NaCl 对 AtNHX1 的上调程度在 abi11(ABA 不敏感突变体 )、 aba21 和 aba31(ABA 缺乏突变体 )中被减少，但在突变体 abi2 sos1(质膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 SOS1 突变体 )、 sos2(蛋白激酶基因 SOS2 突变体 )和sos3(钙结合蛋白基因 SOS3 突变体 )并无类似情况发生。 ABA 诱导的 AtNHX1 的表达同样在 abi11 中被减少，但 abi21 中没有。 这些结果表明，盐胁迫下在转录水平上 AtNHX1 表达的增强，部分地依赖于 ABA 的生物合成和 ABA 通过 ABI1发出的信号。 ABI1 可以调 控 NHX1 等基因的表达， ABI2 则可以通过抑制 SOS2的激酶活性或 SOS2 底物的活性来负调控离子均衡。 液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白的功能研究 目前在这方面的研究主要从以下几方面展开：一是 NHX1 基因表达可部分恢复酵母 nhx1 突变表型 ， Xia 等 【 14】 利用RTPCR 从甜菜 Beta vulgaris NHX1 同源的 BvNHX1 基因。 将 Bvulgaris Na+/H+转运蛋白基因 BvHNHX1 在对盐敏感的酵母 nhx1 突变体ena14nhx1 菌株中异源表达，结果证实 BVNHX1 至少与酵母 NHX1 基因功能部分等价。 Hamada 等 【 15】 从盐生植物 滨藜 中克隆出 Na+/H+转运蛋白，命名 AgNHX1。 内蒙古 大学本科毕业 论文 (设计 ) 同时将其在酵母 NHX1 突变体中表达结果对 NHX1 的功能有部分互补性。 而Gaxiola 等 【 16】 将 AtNHX1 在对 NaCl敏感的酵母 nhx1 突变体菌株中进行异源表达，结果表明 AtNHX1 能抑制 nhx1 突变体的敏感表型， AtNHX1 的某些功能和酵母NHX1 是等价的， AtNHX1 恢复酵母 nhx1 突变体 Na+耐性的功能与酵母内源的ScNHX1 功能相似。 二是拟南芥植物过量表达 AtNHX1 基因，转基因植株在200mmolNaCl的条件下生长发育良好。 Apse 等认为耐盐性的提高与 ANHX1 的高水平转录，翻译及 Na+/H+转运体活性有关 【 17】。 Junsheng Zhao 等 将 AtNHX1 转到 tall fescue (Festuca arundinacea)中，过量表达 AtNHX1 基因可以显著提高转基因植物耐盐性， 200mM NaCl溶液中，显出比对照组更强的耐性。 在根细胞的液泡中积累了更多的 Na+，归 因于 Na+/H+逆向转运体活性的增强。 他们认为 Na+/H+转运体促进 Na+在根细胞的液泡中积累， 减少了盐的毒害作用也就增强了植物耐盐性 【 18】。 Xue 等 【 19】 在小麦中过量表达 AtNHX1，发现转基因小麦在盐土壤中谷粒产量提高，并且谷粒大而重。 在 100~150mM NaCl条件下，转基因植株与对照组相比，叶中积聚的 Na+浓度较低， K+浓度较高。 这些结果表明，提高液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白转录水平，能使小麦的耐盐性及在盐土壤中谷粒的产量提高。 Gaxiola 等 【 20】的实验进一步证实耐盐性是由于液泡转运体的存在，他们将拟南芥液泡膜 Na+/H+逆向转运蛋白基因 AtNHX1 及 H+PPase基因 AVP1 同 时过量表达获得的转基因植株，结果比单独过量表达两者之一的转基因植株具有更强的耐高盐的能力。 这些结果显示拟南芥液泡膜焦磷酸酶 (H+PPase)AVP1 的过量表达，明显增加了转基因植株跨液泡膜质子梯度，促进了 AtNHX1 介导的活性，将 Na+更多的区隔化至液泡。 为了较深入研究 NHX1 基因的作用，国内外研究员做了很多的探讨。 Sottosanto 等通过 TDNA 插入突变体 NHX1 植株和分析 atnhx1 缺失突变体 DNA 芯片，发现 在对照及 100mM NaCl盐胁迫的土壤条件下，探讨成熟植物缺失 AtNHX1 基因对其他转 录本的影响，发现 nhx1 均影响了转录本的表达，而在 100mM NaCl胁迫下基因的变化更大 ；其次，在离子动态平衡方面，细胞内囊泡运输，蛋白质定位以及其它细胞过程中发挥作用 【 21】。 Rajagopal等 【 9】 认为 PgNHX1 功能在整个生命周期都起作用， Na+大都积累在老叶中，种子中极少。 自 1976 年分别首次在动物老鼠肾细胞质膜上和植物大麦质膜上发现 Na+/H+逆向转运蛋白。 后发现的 Na+/H+逆向转运蛋白广泛存在于细菌、酵母、藻类、动物和高等植物的膜系统上。 目前在GenBank 上登录的 Na+/H+逆向转运蛋白 核酸序列达到 500 多个。 包括人类 Na+/H+ 内蒙古 大学本科毕业 论文 (设计 ) 转运体 NHE1【 22】 、盐生植物中间偃麦草 Elytrigia intermedia TiNHX1【 23】 、盐地碱蓬S salsa SsNHX1【 24】 、甜土植物甜菜 BvNHX1【 14】 、经济作物小 麦 TaNHX1【 25】 、水稻OsNHX1【 26】 、刺槐 RpNHX1【 27】 等动植物的 Na+/H+逆向转运蛋白。 本研究的目的及意义 白 刺属（ Nitraria L.）是蒺藜科 (Zygophyllaceae)的古老小属，中国有 8 种，内蒙古有 4 种 .该属植物是我国内蒙古、 甘肃和新疆一带荒漠植被的重要建群种之一，为耐干旱、耐盐碱、抗风蚀沙埋、生长快、易繁殖的优良防风固沙先锋植物。 白刺属植物具有很高的开发利用价值，如营养保健价值、药用价值、生态价值、经济价值等。 而基于白刺特有的耐盐碱抗旱能力，受到盐、碱、旱的三重胁迫，其基因和蛋白水平的表现必定与目前研究的植物耐盐机理存在较大差异。 张建秋等研究发现，他们克隆到的白刺盐碱胁迫相关基因片段与目前已知的植物耐盐基因存在较大差异，这预示着白刺可能存在较特殊的耐盐碱机理 【 28】。 他们通过双向电泳分析白 刺盐胁迫蛋白，发现某些特异性表达蛋白在 其他耐盐植物的研究中没有被 发现，部分证明了可能存在不同于其他植物耐盐性的机理，因此对盐碱均有较高的耐受性 【 29】。 因此从分子生物学角度探讨耐盐机理具有重要的理论意义，目前对白刺的研究主要是生态学方面的，对其耐盐碱基因的报道非常少，还未发现白刺 Na+/H+逆向转运蛋白基因的相关报道。 本研究中我选择了生于轻度盐渍化低地、湖盆边缘、干河床边，可作为优势种并形成群落的小果白刺。 肌动蛋白最初于 1949 年在动物骨骼肌细胞中发现并加以命名，我国科学家闫隆飞等在 1963 年首次提出高等植物存在肌动蛋白 【 30】 ，肌动蛋白广泛 存在于高等植物的各种组织细胞中，如花粉、茎韧皮部、叶表皮细胞、叶鞘细胞、根毛、卷须等，它是构成细胞骨架的主要结构蛋白。 植物肌动蛋白通常由 376377 个氨基酸组成，肌动蛋白利用其分子表面与很多肌动结合蛋白发生相互作用，植物肌动蛋白具有高度保守性。 理想的内参基因应该满足 :①不存在假基因，以避免基因组 DNA 的扩增。 ②稳定表达于不同类型的细胞和组织中，而且其表达量无显著性差别等条件，高度或中度表达，但不是太高或低表达。 ③稳定表达于不同类型的细胞和组织中，而且其表达量是近似的，无显著性差别。 ④表达水平与细胞周期及细 胞是否活化无关。 ⑤不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。 Actin 基因是管家基因之一，在各种不同器官上恒定表达，因而它可以用作分子内标来研究其它基因的表达差异。 现在还没有白刺肌动蛋白基因的克 内蒙古 大学本科毕业 论文 (设计 ) 隆报道，本文旨在克隆其肌动蛋白基因，分析基因序列确证该基因作为分子内参的可能性，为研究白刺其他基因的表达奠定基础。 2 材料与方法 材料 植物材料的培养 实验所用材料为 小果 白刺 （ Nitraria sibirica Pall.），别名 西伯利亚白刺 【 31】 ， 实验室快繁试管苗（陈贵林教授赠予 ），培养基为 1/2MS+IBA mg/L+50mM NaCL, 温度为 (25177。 1)℃ ,光照强度 36~40μ mol m2 s1,光照 时间 14 h d1【 32】。 实验试剂及配制 （ 1） 500mM EDTA 溶液 （提 RNA 用 DEPC 处理水配制） ， pH=. （ 2） 5M Nacl（提 RNA 用 DEPC 处理水配制） . （ 3） 10MLiCl， 4℃保存 . （ 4） 1MTrisHCl（ RNA 用 DEPC 处理水配制） ， pH=,冷却后校正 pH 值 . （ 5） 10 MOPS RNA 电泳液 ， 700mLDEPC 处理的灭菌水溶解 MOPS，用 2M NaOH调 pH 至 ， 加 20mLDEPC 处理的 1M 的乙酸钠和 20mlDEPC 处理的 的 EDTA（ pH=）。 DEPC 水定容至 1L。 （用 的滤膜过滤除菌，室温避光保存） （ 6） 50Tris乙酸（ TAE）缓冲液 成分及终浓度 配制 1L 溶液各成分的用量 内蒙古 大学本科毕业 论文 (设计 ) 242g Tris ml 的冰乙酸（ mol/L） 200ml 的 mol/L EDTA（ pH ） 补足 1L （ 7） CTAB 提取 RNA 缓冲液为： 2% (w/v)g/ml CTAB 100 mmol/L TrisHCl (pH ) mol/L NaCl 20 mmol/L EDTA (pH ) % β 巯基乙醇 (使用前加入 ) DEPC 处理水 定容到 500 ml （ 8） TE buffer（ 10mM Tris pH=、 1mM EDTA pH=） . （ 9）酚 /氯仿 /异戊醇 phenol/chloroform/isoamyl alcohol (PCA 25： 24： 1) 25份水平衡酚， 24份氯仿， 1 份异戊醇混合，加入 8羟基喹啉 Hydroxyquinoline，使其终溶度为 %. （ 10） 氯仿 /异戊醇 chloroform/isoamyl alcohol (CA 24： 1) （ 11） 水平衡酚 制备 500g 苯酚加入 200ml 灭菌 DEPCH2O ，平衡，直至饱和， 加入 8羟基喹啉 Hydroxyquinoline，终溶度为 %. （ 12） 3M 醋酸铵（ pH ） . （ 13）氨苄青霉素 Ampicillin (100mg/ml )， m过滤膜过滤除菌 . （ 14） IPTG (24mg/ml) ， m过滤膜过滤除菌 . （ 15） XGal （ 20mg/ml） ， 加入 DMF(二甲基甲酰胺 )溶解，使其终浓度为 80%，20℃避光 保存。 （ 16） LB 培养基 （ 1%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， 1%NaCl， pH ） （ 17） LB/AMP 培养基 （ 1%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， 1%NaCl， Ampicillin （ 18） SOB 培养基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl） 内蒙古 大学本科毕业 论文 (设计 ) （ 19） SOC 培养基 （ 2%（ W/V） Trytone， % Yeast Extract ， %NaCl， KCl， 10mM MgCl， 20ｍ M 葡萄糖 （ 20） TB 溶液 Transformation Buffer HEPES 10mM， 15mM， KCl 250mM，加入蒸馏水 950ml， 用 5M KOH 调 PH至 ，低 PH 不溶 ， 在加终浓度 为 55mM 的 ， 定溶到 1L, 过滤灭菌 , 4 度保存。 实验使用试剂盒 （ 1） TaKaRa RNA PCRKit（ AMV） （ 2） AXxyPrep DNA 凝胶回收试剂盒 实验用引物 实验用 引物由 invitrogen 公司合成 DegNHXF： 5’ CCICCIATHATHTTYAAYGCIGG 3’ PPIIFNAG DegNHXR： 5’ RTAIGCCATIARCATCAT 3’ MMLMAY Deg Act1： 5’ ATGGTIAARGCIGGITTYGC3’ MVKAGFA Deg Act2： 5’ CCACATYTGYTGRAAIGTIS3’ STFMW 3’RACE 特异性引物 NHXGSPF（ 1） ： 5’ATTTTGCCAGGCACTCAA3’ NHXGSP。