用同源重组的方法进行基因修复毕业论文(编辑修改稿)

用同源重组的方法进行基因修复毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

uncture Structure) 的形成和拆分分为三个阶段，即前 联会 体阶段、 联会 体形成和 Holliday 结构的拆分。 经过生物技术演变，同源重组成为了将外源基因与受体染色体 NDA 上的同源序列之间发生互换，从而改变受体基因的特定序列，并最终改变基因的遗传特性的方法 ［ 1］。 并在基因检测，重组基因表达方面有广泛的应用。 同源重组的发展史 在 1956 年，加利福尼亚大学伯克利分校的 Clark 就对 的重组进行了基因分析，并发现了与基因同源重组有关的酶 RecA 及 RecBCD。 他们发现RecA 蛋白质有两个键合位点，分别与单链挤双链 DNA 结合，在试管里能从某些小病毒里提取的单链 DNA 结合，这样以来，包裹着蛋白质的 DNA 就会 “侵犯 ”完整的双螺旋 DNA，把它的互补链分开，这个包裹蛋白质的链不断的试探着双螺旋结构，直到找到与它同源互补的序列，他就会插入到 DNA 的双链中，形成一个三链结构，如果有足够长的同源重组的序列， RecA 就会被激活为一个交换型结构，催化链交换反应，最终形成一个新的双螺旋结构。 原来双螺旋结构中的 一个互补链拋充了另外的配对链， RecA 蛋白脱落。 由此而产生的结构叫做 “D 环 ”。 RecBCD 蛋白的功能是从 DNA 双链的一段进入往 DNA 的另一端运动，在运动过程中他会将 DNA 的双链分开，并与此同时将分开的两个 DNA 单链绞在一起。 但是它的聚合速度比分离速度要慢，所以最终将会在 DNA 的两侧各形成一个不断增大单链 DNA 的环。 在某些情况下， RecBCD 蛋白质不仅把 DNA 链分开，而且将他们切开。 生化实验表明： RecBCD 蛋白质使一段单链 DNA 和所在染色体分北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第一章同源 重组技术的研究进展 3 开，在 RecA 蛋白质的帮助在，这根自由的链和另一个染色体的一根链上的互补序列形成一个新的双螺旋结构。 由于同源重组能按实验设计进行基因的定点突变，由此产生的转基因代替数对于研究基因结构与功能及表达调控具有极重要意义，通过定点突变而改变单个碱基或几个碱基导致核苷酸序列发生改变，从而改变该基因的功能。 例如，如果我们推测在弄得发育过程中包括有某一特殊基因的作用，这样我们通过基因打靶将正常基因 “knock out”，而代之以错误的基因，这样导致正常基因的完全失活，如果具有这中基因结构的新生鼠有畸形的 小脑，则我们可以确定这个基因是小脑发育正常所必需的基因。 绝大部分对小鼠 ES 细胞基因打靶的结果对于人基因结构和功能的研究具有重要意义。 Red同源重组技术 red同源重组技术的研究进展 Red 重组系统是一种基于噬菌体 Red 重组酶的同源重组系统， Red 同源重组系统由三种蛋白组合： EXO 蛋白是核酸外切酶，结合在双链 DNA 的末端，从 5’端向 3’端降解 DNA，产生 3’突出端， Beta 蛋白结合在单链 DNA 上介导互补单链DNA 退火， gam蛋白可与 RecBCD 酶结合抑制其降解外源 DNA 的活性， Red 同源重组技术 具有同源序列端、重组效率高的特点。 Red 同源重组技术的原理是将一段携带与靶基因两翼各有 40~60bp 同源序列的 PCR 片段导入宿主菌细胞，利用 K 噬菌体 Red 重组酶的作用是导入细胞的线性 DNA 片段与染色体的特定扒啊序列进行同源重组，靶基因被标记基因置换下来。 ［ 2］ PCR引物由两部分组成，靠近 5c端的区域为与把基因同源的序列（约 40bp），靠近 3c 端的区域（约 20bp） 与模版 DNA 互补。 这种重组技术是最近发展起来的一项可在染色体水平上进行遗传操作的新技术，只需较短的同源序列，而不需要特定的限制性酶切位点，即可在生物体内完成重组过程，省去了体外 DNA 酶切、连接等步骤。 这样，靶基因两翼序列已知的条件下就可以通过 Red 重组技术对该基因进行跳出、敲入、点突变等操作，还可在靶基因的上下有加入适当的启动子和中只字序列一条街基因的表达。 将含有 ori 复制序列的线性载体片段导入细胞，也可将靶基因克隆于载体上。 实验证明，这种基因打靶技术是基因功能研究和新菌株构建的有力工具。 北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第一章同源 重组技术的研究进展 4 red同源重组的 筛选以及标记基因的剔除 虽然 Red 同源重组的效率很高，但是在同源重组过程中还是会有许多的菌落未重组成功，这就需要标记基因的介入，就是将需要重组的基因连接在一个标记基因上，将其一起同组到大肠杆菌的基因组。 但是大肠杆菌中携带标记基因，这样就可能对重组菌以后的表达产生影响，所以标记基因的剔除也是同源重组中至关重要的一步。 一般通过以下四种方法完成标记基因的剔除： （ 1）如果线性 DNA 中含有 ori 基因那么，可以一步筛选法将中间为筛选基因两端为同源序列的标记基因重组下来。 （ 2）筛选和反向筛选的结合使用，在第一步同源重组过程将两个标记基因导入到载体上，然后通过正向基因将其筛选出来，然后进行第二补同源重组，用反向标记基因筛选出重组成功的基因。 （ 3）筛选与位点特异性重组的结合，把筛选标记基因的两侧加上 FLP 位点，FLP 位点具有特异性同组酶识别的作用。 应用此方法有一个缺点就是会在基因上留下 34 或 36bp 的特殊序列。 （ 4）筛选和限制性内切反应的结合，和第三种方法类似在标记基因的两次加上限制性酶切位点，然后利用酶切反应将标记基因切除。 CRISPR介导基因的编辑技术 CRISPR介导基因的编辑技术的研究进展 基因打靶，尤其是同源重组技术出现之后，无论是在科学研究，还是在工业生产上都有了革命性的变革。 但是同源重组技术仍有很有的弊端需要改进，尤其是重组菌株的筛选与筛选基因的敲出，这个过程使得同源重组产生过程复杂、效率降低以及工作周期长等弊端。 一种人工核酸内切酶的出现改变了这一现状。 ［ 3］ 锌指核酸内切酶 (zinc finger endonuclease， ZFN)是人类所创造的第一代核酸内切酶，锌指是指的一类能够结合 DNA 的蛋白质，人类细胞转录因子中几乎有一半含有锌指结构， ZFN 是将锌指蛋白和核酸内切酶 Fok1 融合形成的核酸内切酶，利用他能够在各种复杂基因组的特定位置创造 DNA 的双链切口的这一特性。 它应用于黑长尾猴、小鼠、斑马鱼、果蝇、烟草、人类 ips 细胞甚至 HIV 的药物生产。 不过 ZFN 不是那么完美，它也有一些弊端，比如制备复杂，成本昂贵，最重要的是其专利被少数几个商业公司所控制，这样就会限制它在科研与生产方面的应用。 后来，第二代人工核酸酶 ——类转录激活因子效应物核酸酶，它的出现在北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第一章同源 重组技术的研究进展 5 一定程度上替代了 ZFN。 20xx 年，科学家将一种水稻的致病菌编码的累转录激活因子效应物与 DNA 的 碱基进行了对应解密。 20xx 年， TALEN 蛋白在成功应用于酵母之中。 TALEN 可以像 ZFN 那样，对复杂懂得基因组进行修饰，另外他的构建简单，特异性强，受到了诸多科研工作者的喜爱。 ZFN 和 TALEN 的工作原理相同，都是将 DNA 蛋白与核酸内切酶 Fok1 融合而成。 20xx 年， CRISPR/cas9 出现，它主要根据大肠杆菌的自主免疫，然后将已有的基因进行改造而成。 其具有制备简单、成本低、作用高效等特点。 CRISPR 序列是由日本科学家在大肠杆菌中首次发现的 ［ 4］ ,但是这段序列的功能无法被当时的科学界确定，因此它一直 没有受到有关科研人员的重视， 1995 年，西班牙的科学家们在地中海极嗜盐菌和沃尔卡尼极嗜盐菌的研究中第二次发现这个结构，之后，此结构也被陆续报道，但是直到多种细菌的基因组测序完成之后，科学家发现这种串联重复结构在细菌和古生菌中存在非常的广泛。 科学工作者便开始对其的研究，并将其正式命名为 CRISPR。 1987 年， CRISPR 被发现之后，它的作用一直以来就是一个谜团，不曾被人们破解，不过对着人们分子生物学研究方法的日益成熟，人们对基因序列的认识更加的广阔，以及大量的病毒和质粒的遗传信息的记录整理， CRISPR 序列的功能最终被发现。 20xx 年，有 3 个研究小组同时发现了 CRISPR 序列中的间隔序列与宿主菌的染色体外遗传物质的高度的相似。 因此，科学家们推测 CRISPR 与抗外来基因入侵的自主免疫作用有关。 根据这个推测科学家们开始对其进行这一方面的研究，随后便发现细菌中的 CRISPR 可以对抗噬菌体的入侵，以及外来质粒的转移，并用实验证明了这一理论。 北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第一章同源 重组技术的研究进展 6 CRISPR的原理 图 11 CRISPR 工作原理 CRISPR/cas9 基因编辑技术是 ZFN 和 TALEN 之后迅速发展起来的第三代基因编辑技术，该技术是细菌以及古生菌中存在的 Ⅱ 型 CRISPR/Cas 基因进行改造而形成的。 它可以针对噬箘体感染、质粒接合所造成的基因侵入而形成的特异性的防御。 该过程分为 3 个阶段：适应、表达和干扰。 （ 1） 适应 当噬菌体 DNA 侵入菌体时， CRISPR 系统就会知道合成 cas 蛋白， cas 蛋白将对其 DNA 进行切割，使其形成无数个 30bp 左右的 DNA 片段。 然后将其整合到 CRISPR 导向序列之后重复序列之前的位置，使其形成一个新的 spacer。 每次插入都伴随这重复序列的复制，这样就可以保证 CRISPR 中存在次噬菌体的序列信息，为适应性免疫做基础。 另外，科学家 研究发现， CRISPR 位点中间区的个数越多对噬菌体的抵抗力就越强。 （ 2） 表达 当同类噬菌体再次入侵该宿主菌时， CRISPR 位点的转录水平就会迅速上升，生成重复序列和间区的前体 precrRNA，之后被 cas 蛋白切成更小的 crRNA，即成熟的 1 个间隔序列和部分的重复序列。 北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第一章同源 重组技术的研究进展 7 每段的边距保持一致 （ 3） 干扰： crRNAs 干扰入侵核酸 crRNP 将会通过 crRNA 迅速寻找与其互补的 DNA 片段，并进行特异性结合，然后在复合体的作用下将其降解，从而达到保护宿主菌的作用。 北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第二章 质粒 ptarget 的构建 8 第二章 质粒 ptarget的构建 1 材料 表 11 菌株和质粒 Table 11 Strains and plamids 菌株和质粒 Strains and plamids 基因型或表现型 Genotype or phenotype 来源或文献 Source of reference Strains： E． coil DH5α Plamids： PtargetlacZ Cloning of bacteria 博迈特 Biomed This lab 1． LB 培养基： 1000ml （高压灭菌） 胰蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g TE（ ）： 10mmol/L trisHCL () 1mmol/L EDTA () 1XTAE： 40mmol/L trisCH3COOH 1 mmol/L EDTA Gel safe 溶胶液 1000ml 100ul gel safe 定溶至 1000ml 北京电子科技职业学院生物工程学院毕业论文 第二章 质粒 ptarget 的构建 9 、试剂和试剂盒 生化与分子生物学试剂购自原平浩试剂公司、上海生工生物公司、鼎国生物公司： taq 酶及 PCR 相关试剂购自 TAKARA 公司，化学试剂为分析纯， PCR 引物由中美泰合合成。 核酸回收试剂盒 QLAEX Ⅱ 购自 Qiagen。 根据 wtBL21 上的突变位点，利用 serial cloner 分析软件设计合成下列引物： 引物 序列 长度（ bp） Tm（ ℃ ） PF_aroF_apc PF_gabD(2)_spc PF_gabD_spc PF_gabT_spc PF_lplA_spc PF_talB_spc PF_tnaB。