颅脑疾病重点实验室开放课题项目申请书化脓性脑膜脑炎脑脊液细菌16srrna检测和功能分析(编辑修改稿)

颅脑疾病重点实验室开放课题项目申请书化脓性脑膜脑炎脑脊液细菌16srrna检测和功能分析(编辑修改稿)内容摘要：

acNeil IA,Tiong CL,Minor C,et al. Expression and isolation of antimicrobial small molecules from soil DNA libraries[J].J Mol Microbiol Biotechnol,20xx,3(2):301308. [17] Gill SR,Pop M,Deboy RT,et analysis of the human distal gut microbiome[J].Science,20xx,312(5778):13551359. [18] Breitbart M, Hewson I,Felts B,Mahaffy JM,Nulton J,Salamon P,Rohwer analyses of an uncultured viral munity from human feces[J].Bacteriol,20xx,185(20):6220 6223. [19] Walter J,Mangold M,Tannock ,analysis,and betaglucanase screening of a bacterial artificial chromosome library from thelargebowel microbiota of mice[J].Appl Environ ,71(5):23472354. [20] DiazTorres ML,Villedieu A,Hunt N,et the antibiotic resistance potential of the indigenous oral microbiota of humans using a metagenomic approach[J].FEMS Microbiol Lett,20xx,258(2):257262. [21] Manichanh C,RigottierGois L,Bonnaud E,et diversity of faecal microbiota in Crohn39。 s disease revealed by a metagenomic approach[J].Gut,20xx,55(2):205211. [22] Wenderoth DF,Ferslev B,Macarri G,et of microbial biofilm munities causing occlusion of biliary stents[J].Environ icrobiol,20xx,22:859866. [23]Mira A,Ochman H,Moran bias and the evolution of bacterial enome[J]. Trends Ge,20xx,17:589596. （二） 研究内容、预期目标、拟解决的主要问题 1 研究内容 PCR 扩增细菌 16S rDNA 序列 16S rDNA序列 具有以下特点：（ 1）多拷贝： 16S rDNA编码基因以多拷贝形式存在于所有细菌染色体基因组中，每个细菌约含 5～ 10个拷贝，这使得对该基因的检测具有敏感性。 （ 2）多信息： 16S rDNA编码基因内部结构由可变区和保守区组成。 保守区为所有细菌所共有，细菌间无差别，有 “ 分子化石 ” 之称。 可变区在不同细菌之间存在有不同程度的差异，具有属或种的特异性，可变区与保守区交错排列。 可根据保守区设计各种细菌的通用引物，也可根据可变区设计特定细菌的特异引物或探针。 16S rDNA基因可变区所含信息的种间 差异使检测具有特异性。 （ 3）长度适中： 16S rDNA编码基因长度适中，约 1500bp，不像 23S rDNA基因序列太长不易进行全序列测定，因此，各种细菌 16S rDNA基因的测序工作在微生物学界成为热点。 目前，人体液中常见病原菌的16S rDNA基因几乎全部测序完成，为细菌的基因诊断提供了条件 ， 16S rDNA编码基因的这些特点使之成为较理想的细菌基因分类的靶序列，逐渐成为细菌鉴别、分类的金标准。 CSF 中细菌分类分析 使用 BLASTN 将序列比对到 16S rDNA 数据库。 挑选其中的最佳比对结果。 没有比对上数据库的序列不给出物种分类信息。 BLAST 有多个结果的序列会根据众数原则，也就是如果 66%的比对结果都支持同一个物种分类，那么就认为是属于那个物种分类的。 如果不符合要求，就向上一个物种分类等级再做比对。 CSF 中物种丰度分析 首先，计算 tag 的丰度分布；然后， 为了更好地获得样品的细菌丰度，可基于 tag采用 OTU 分析的方法。 化脓性脑膜脑炎患者 CSF 中致病菌的系统发生学分析 基于 16S rDNA V6 序列差异的大小，对一些类群构建系统发育树。 不同阶段 样品 间的比较分析 基于系统进化，功能注释的多样品比较分析可寻找 细菌 分类上的显著差异。 2 研究目标 PCR 扩增细菌 16S rDNA 序列，为 细菌分类 及后续分析做准备； 通过基因测序 ， 运用不同的分析方法和手段推测基因的种属来源 、表达丰度、 建立 系统发生树 并对 不同阶段 样品间的比较分析 寻找 细菌 变化的 显著差异。 3 拟解决的关键问题 本研究运用 新一代高通量测序技术 —— 16S rDNA 宏基因组测序技术 ，对的 V6 可变区进行测序分析，不需进行克隆筛选，测序的 通量高，获得的 数据量大，周期短，能更加全面的反映 样本的物种组成、真实的物种分布及丰度信息。 测序后 运 用 不同分析方法和手段进行生物信息学分析，可得到 物种分类、群落结构、系统进化、功能注释等信息。 所以测序和生物信息学分析是本研究的关键，本课题组将借助 深圳华大基因研究院生物信息中心 在基因组测序和生物信息学分析方面的强大优势来完成本课题的研究。 （三） 研究方法、技术路线、实验（设计）方案及可行性分析 1 研究方法 选取 宁夏医科大学附属医院神经内科确诊为化脓性脑膜脑炎患者 1~2 例 ，对此患者进行动态观察，分别收集入院时 、 治疗 3 天 、 7 天 、 12 天 时 的 CSF 标本 ， 应用 通 用引物扩增细菌 16S rDNA 序列， 采用 16S rDNA 宏基因组测序技术 对样品 16S rDNA 的 V6可变区进行测序，并拼接成 Tag，并根据 Tag 进行物种分类、 OTU 分析、多样性分析、比较分析等 可得到化脓性脑膜炎患者 CSF 中菌 群的物种分类、物种丰度、系统进化、功能注释等信息。 2 技术路线 图 3 实验方案 样本采集 拟收集宁夏医科大学附属医院 20xx 年 5 月至 20xx 年 8 月 确诊 化脓性脑膜脑炎患者1 例 ，分别取此患者入院时 、 治疗 3 天 、 7 天 、 12 天 时 CSF 各 1~2ml； 化脓性脑膜脑炎的临床诊 断标准： （ 1）有或无近期呼吸道或肠道感染史，有或无中耳炎、鼻窦炎等病史； （ 2）有发热、头痛、呕吐、抽搐等症状，有嗜睡、谵妄或昏迷等意识障碍； （ 3）体格检查：颈项强直、 Kernig征及 Brudzinski征阳性，但成人患者阳性率仅 50％，故对阴性者不能排除诊断；视乳头水肿，脑神经麻痹； （ 4）辅助检查 ① 血常规：白细胞计数明显增多，可达 (20～ 40) 109／ L，中性粒细胞达 90％以上； ② CSF检查： CSF压力 200mmH2O，外观混浊或呈脓性，糖 ，氯化物120mmol/L，蛋 白质 ，未经治疗的化脓性脑膜脑炎白细胞数高于正常水平，为(1000～ 10000) 106／ L，以中性粒细胞升高最为明显；但亦有 10％患者以淋巴细胞升高为主。 CSF涂片镜检及细菌培养发现病原菌为诊断金标准； ③ 血细菌培养：血培养阳性具有确定病原的价值； ④ 脑 CT早期正常，病程进展可见脑膜呈线状强化，硬膜下积液可见颅骨内板下新月形低密度区，包膜形成时可见内膜强化，室管膜炎及脉络膜炎时脑室壁呈线状强化，脑积水显示脑室扩大，脑实质受损可见低密度区和占位效应； ⑤ 脑 MRI早期脑膜及皮质呈条状信号增强，脑组织广泛水肿，脑沟和脑裂变小；中期皮质和皮质下梗死， T1WI低信号， T2WI高信号；后期可见脑积水、硬膜下积液及脑萎缩等； 排除以下疾病：颅脑外伤、脑肿瘤、 颅内出血、其它致病微生物所致颅内感染、脑白质病变、代谢性脑病等。 样本的处理 从 80℃ 冰箱取出 CSF样本，室温解冻 ， 分别将每份 CSF混匀后， 于 Effendorf管中，采用差速离心法对样本中的细菌进行富集。 提取 CSF 总 DNA 应用 IsoQuick 试剂盒提取样本中的总 DNA，按照试剂 盒操作说明进行。 DNA片段大小、浓度、纯度测算 样品 DNA 浓度以及大小的测算是用已知浓度的 Marker 作为对照和样品 DNA同时电泳根据 DNA条带亮度推算出 DNA的大概浓度，根据 DNA条带位置推 算出 DNA的大概片段长度，样品 DNA纯度估计是将 2μ l DNA样品稀释至 500μ l后测定260nm和 280nm下样品的 OD值，通过样品 OD260/OD280 的值来进行估计的。 OD260/OD280 在 ，小于 DNA或RNA，大于 品中含有较多的蛋白。 16S rDNA 引物的选取与 PCR 扩增 本研究选择 16S rDNA 基因通用引物： 27F(5’ AGAGTTTGATCCTGGCTCAG3’ )和 1492R(5’ TACTTGTTACGACTT3’ )，进行 PCR 扩增。 反应产物保存于 4 ℃ 备用。 测序与生物信息学分析 将 PCR扩增产物送去测序（本部分 在 深圳华大基因信息研究院生物信息中心完成）。 采用与新一代高通量测序技术相结合的 16S rDNA Metagenomes 测序技术，对样品 16S rDNA 的 V6 可变区的 PCR 产物进行测序，并拼接成 Tag，并根据 Tag 进行 细菌 分类、OTU 分析、多样性分析、比较分析等。 测序 及分析 流程： （ 1）进行原始数据的处理： ① 去除有 adapter 污染的序列 ； ② 数据的拼接：运用华大研发的 overlap 拼接软件对数据进行拼接，得到拼接的结果。 通过重叠关系将两条两端测序得到的序列组装成一条序列。 拼接的条件是最小匹配长度为 5bp，重叠区域不允许错配， N 所占最大百分比是。 为了更多的利用序列，不满足以上结果的序列将各切除 5bp 继续组装，如此重复多次。 最终产生的就是 V6 区的序列。 ③ 去除引物：挑出完全匹配引物的序列，而不匹配的序列不进行后续分析，去除 V6 区两端的引物。 去除引物后剩下的序列称为 tag。 （ 2） 细菌 复杂度分析：计算 tag 的丰度分布。