靶向mrp1基因prnat-h11以及shuttle-rfp重组质粒表达载体构建_毕业设计论文(编辑修改稿)

靶向mrp1基因prnat-h11以及shuttle-rfp重组质粒表达载体构建_毕业设计论文(编辑修改稿)内容摘要：

本课题在国内外的研究现 状 多药耐药蛋白基因 1 编码的多药耐药蛋白的过度表达是重要的 肿瘤 耐药机制之一。 RNAi 是一种用 dsRNA 作为序列特异性的触发器指导同源单链 RNA 降解的细胞机制。 在最近的研究中显示特定目的基因的表达可被 RNA 干扰高效抑制。 小干扰 RNA(siRNA)作为一种中间介质，介导哺乳动物细胞中与之同源 基因 的 沉默 [28]。 RNAi 的 作为 一种经济、快捷、高效的技术手段， 正逐步被应用于遗传性疾病、病毒性疾病 以及肿瘤等的基因治疗。 从 1990 年，植物学家对矮牵牛花注入红色素基因，却使花变成白色，到 1995 年Su Guo 博士利用 线虫完成的实验，科学家首次发现了 RNA 干扰的现象，但是并未能对其理论做出合理解释。 直到 1998 年， Andrew Fire 等证实 Guo 等发现的正义 RNA抑制同源基因表达的现象是由于体外转录制备的 RNA 中污染了微量 dsRNA 而引发， Andrew Fire 和 Craig Mello 将这一现象命名为 RNAi，并于 1998 年在 Nature上发表了相关论文。 随后的研究中发现， RNAi现象广泛存在于果蝇， 线虫， 斑马鱼，真菌以及植物等生物体内，这些生物体利用 RNA 干扰 来抵御病毒的感染，阻断转座子的作用。 近几年来 RNAi 的研究 取得了很大进展 ,20xx 年它被《 Science》杂志评为十大科学成就之一 ,20xx 年被评为十大科学成就之首。 [29]自 20xx 年 5 月以后，先后出现将RNAi 技术应用于抑制艾滋病病毒、丙型肝炎病毒（如美国科学家 Mc Caffrey）和癌细胞（如我国徐根兴教授）的研究报道。 这一发现提示可以应用 RNAi 技术来抑制 MRP1基因的蛋白表达。 Nieth C 等（ 20xx）发现临床上化学合成 siRNA 更适于联合治疗，可以利用化学合成的 siRNA 同时转录多种 MRP 相关基因，如其他 ABC 转运编码基因或细胞凋亡编码基因等，而且也 可同时编码其他致癌基因或血管生成因子进行联合治疗20xx 年诺贝尔生理学或医学奖授予两名美国科学家，以表彰他们发现了 RNA 干扰现象。 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 8 由于 RNAi 技术的高效性和高度特异性， RNAi 已成为颇为理想的细胞水平基因敲除工具，并迅速成为后基因组时代功能基因组学研究中不可或缺的重要手段，并为基因治疗开辟了新的途径。 现 RNAi 已广泛应用到 HIV、病毒性肝炎、基因治疗及药物筛选探索中，对肿瘤细胞多药耐药性干扰作用的研究也正在迅速发展中，随着研究的深入和发展，将为 MRP 细胞的逆转提供一个安全有效的途径。 本论文的研 究目的及意义 癌症严重威胁着人类的健康，其发病率呈上升趋势。 化疗作为其常规临床治疗手段，在癌症治疗中具有手术和放射治疗不能替代的作用。 肿瘤细胞的多药耐药性是导致肿瘤细胞化疗失败的主要原因。 肿瘤细胞产生多药耐药的原因较为复杂，多药耐药相关蛋白1 的过度表达是导致其产生多药耐药的主要原因之一。 RNA 干扰是近年来发现的能快速、高效、特异的沉默目的基因表达的技术，如能通过 RNAi 技术沉默 MDR1 基因，逆转肿瘤细胞的多药耐药性将为改善癌症病人的化疗效果奠定基础。 本实验针对 mrp1 基因设计并合成了两对能编码 siRNA 的 DNA 片段，进而构建，为研究以 RNAi 技术逆转肿瘤细胞多药耐药提供实验基础。 本论文的主要内容 依据研究的目的及实验思路，本论文主要内容包括 1． 根据肿瘤细胞的 mrp1 基因核苷酸序列，按照靶位点的寻找原则，设计并合成 2个编码 shRNA 的 DNA 模板 shmrp11 和 shmrp12。 2．。 3．质粒 载体 经 Hind Ⅲ 和 BamH I 双酶切，并进行胶回收。 4． 载体 与设计合成的 干涉 片段连接，构建靶向 MRP1 基因 重组质粒表达载体。 5．用 已 构建的靶向 mrp1 基因 杆菌 DH5α 进行菌落 PCR，检测重组质粒构建是否正确 ；重组质粒大量提取，进行 OD 值检测。 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 9 第 2章 实验材料与方法 实验材料 宿主菌 DH5α：为感受态宿主菌由北京鼎国生物技术有限责任公司提供。 质粒载体 ，该质粒源自Genscript 公司（ Scotch PlamsUSA）。 ： ， shRNA 的表达由人的转录启动子 H1 Promoter 启动， H1 启动子属于 PolⅢ 启动子，该启动子总在其下游的固定距离开始转录合成 RNA，转录过程遇到 4~5 个连续的 U 即终止，非常精确；同时 CMV Promoter 为真核生物启动子，可在该质粒中高效启动红色荧光蛋白（ Red Fluorescence Protein， RFP）的表达； MCS 为多克隆位点。 质粒图谱 见图 21 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 10 p R N A T H 1 . 1 / S h u t t l e R F P6 1 6 8 bpA m p c i l l i n ( 4 7 4 6 5 6 0 6 )N e o m y c i n ( 2 4 5 0 3 2 4 4 )P 1 S c e 1 ( 1 8 0 2 )P o l y A ( 1 3 5 1 )R F P (6 4 1 1 3 3 6 )S V 4 0 P ro m o t e r (2 0 6 4 2 4 0 9 )H 1 p r o m o t e r ( 6 0 4 3 6 1 4 2 )C M V P ro m o t e r ( 3 7 6 2 4 )p U C o ri ( 3 9 5 8 4 5 9 8 )B a m H I ( 61 4 4 )H in d I I I (6 1 6 2 )K p n I (6 1 6 0 ) 图 21 Detailed map of 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 11 载体通用引物 正向引物（ M13）： 5′GTTTTCCCAGTCACGAC3′ 反向引物（ Rev）： 5′ GAGTTAGCTCACTCATTAGGC 3′ 主要试剂及工具酶 质粒快速提取试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限司 Sanprep 柱式 DNA 胶回收试剂盒 上海生工生物工程技术服务有限司 10PCR buffer 北京鼎国生物技术有限责任公司 dNTP 上海生工生物工程技术服务有限司 Marker(1kb,100bp) 上海生工生物工程技服务有限公司 Goldview DNA 染料 北京赛百盛基因技术有限公司 吖啶橙 北京鼎国生物技术有限责任公司 氨苄青霉素 上海生工生物工程技术服务有限司 EDTA Bio Basic Inc 溶菌酶 北京鼎国生物技术有 限责任公司 LiCl Amresco RNase Sigma bactotyptone Bio Basic Inc bactoyeast extract Bio Basic Inc PEG8000 北京鼎国生物技术有限责任公司 TriS 饱和酚 北京鼎国生物技术有限责任公司 HindⅢ NEB 公司 BamHI NEB 公司 T4DNA 连接酶 NEB 公司 Taq 酶 北京鼎国生物技术有限责任公司 电泳缓冲液及培养基 50TAE 电泳缓冲液： Tris 碱 242g，冰乙酸 ， EDTA（ Na2EDTA2H2O） 溶水，定 容 至 1000mL。 10TBE 电泳缓冲液： Tris 碱 54g，硼酸 ， EDTA（ 5M， ） 20ml， ddH2O定容至 500ml。 LB 液体培养基：将 bactotyptone 2g、 bactoyeast extract 1g 和 NaCl 2g，溶于 195mL 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 12 双蒸 H2O，溶解后用 5MNaOH 调 PH 值至 ，定容至 200ml，共配置 5 份， 121℃ 湿热灭菌 30min。 固体选择培养基（ Ampr）：每 100ml LB 液体 培养基中加 琼脂粉， 121℃ 湿热灭菌 20min，待温度降至 60℃ 加入终浓度为 50μg/mL 的氨苄青霉素，混匀后倒平板， 4℃保存备用。 大提质粒溶液配置 (1)溶液 I： 50mmol/L C6H12O6， 25mmol/L TrisHCl（ ）， 10mmol/L EDTA（ ）。 (2)溶液 II： ， 1% SDS。 (3)溶液 III： 5mol/L KAc600mL， 冰乙酸 115mL， H2O 285mL。 (4)溶菌酶（现用现配）：取 溶菌酶溶 于 10mL 10mmol/L TrisHCl（ ）。 (5) PEG8000 缓冲液：取 PEG8000 溶于 50mL。 (6) 70%乙醇：取 300mL 无水乙醇溶于 700mL 水中。 (7) TE（ ）缓冲液： 1mol/L TrisHCl（ ） 500μL， mol/L EDTA（ ） 100μL，加水至 50mL。 主要仪器 微量振荡器（ MM2 型） 上海像华化工有限公司 微量振荡器（ MM2 型） 上海像华化工有限公司 恒温空气摇床 北京鼎国生物技术有限责任公司 电子天平 北京赛多利斯天平有限公司 紫外分析仪（ ZF 型） 上海康华生化仪器制造厂 低温离心机（ SK18） SIGMA 公司 低温离心机（ SK18） SIGMA 公司 PCR 仪（ 9600 型） ABI 恒温磁力搅拌器（ 20xx16） 常州国华电器有限公司 恒温水浴锅 上海跃进医疗器械厂 自动双重纯水仪 上海博通仪器厂 齐齐哈尔大学毕业设计 (论文 ) 13 实验方法 shRNA的设计与退火 根据 siRNA 设计原则 [34]，根 据 MRP1 靶序列，设计合成四对互补反向重复脱氧核糖核酸序列，中间间隔 9nt 茎环序列 (TTCAAGAGA)， 5′端带有 BamHⅠ 酶切位点， 3′端带有 HindⅢ 酶切位点，用 BLAST 进行同源性分析，确定与其他基因无同源性。 shRNA的 DNA 模板由上海生工合成，单链干涉片段退火后形成双链。 干涉靶点在 mrp1 基因 mRNA 全序列中的位置如下 (粗体代表靶序列 )： 1 ccaggcggcg ttgcggcccc ggccccggct ccctgcgccg ccgccgccgc cgccgccgcc 61 gccgccgccg ccgccgccag cgctagcgcc agcagccggg cccgatcacc cgccgcccgg 121 tgcccgccgc cgcccgcgcc agcaaccggg cccgatcacc cgccgcccgg tgcccgccgc 181 cgcccgcgcc accggcatgg cgctccgggg cttctgcagc gccgatggct ccgacccgct 241 ctgggactgg aatgtcacgt ggaataccag caaccccgac ttcaccaagt gctttcagaa 301 cacggtcctc gtgtgggtgc cttgttttta cctctgggcc tgtttcccct tctacttcct 361 ctatctctcc cgacatgacc gaggctacat tcagatgaca cctctcaaca aaaccaaaac 421 tgccttggga tttttgctgt ggatcgtctg ctgggcagac ctcttctact ctttctggga 481 aagaagtcgg ggcatattcc tggccccagt gtttctggtc agcccaactc tcttgggcat 541 caccacgctg cttgctacct ttttaattca gctggagagg aggaagggag ttcagtcttc 601 agggatcatg ctcactttct ggctggtagc cctagtgtgt gccctagcca tcctgagatc 661 caaaattatg acagccttaa aagaggatgc ccaggtggac ctgtttcgtg acatcacttt 721 ctacgtctac ttttccctct tactcattca gctcgtcttg tcctgtttct cagatcgctc 781 acccctgttc tcggaaacca tccacgaccc taatccctgc ccagagtcca gcgcttcctt 841 cctgtcgagg atcaccttct ggtggatcac a。