酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究毕业论文(编辑修改稿)

酵母工程菌表达的几丁质酶分离及酶学性质研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

蒸馏水中，调节 pH 至 ，高压灭菌 20 min。 ⑤10M （ 5 % Methanol，甲醇）：将 15 mL 甲醇与 285 mL 蒸馏水混合，过滤除菌后 4 ℃ 保存备用。 （ 2）常用培养基的制备 ①BMGY 培养基：称取 5 g 酵母提取物， 10 g 胰蛋白胨，溶于 350 mL 蒸馏水中，高压灭菌 20 min，然后冷却至室温，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、50 mL 10GY 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存备用。 ②BMMY 培养基：称取 5 g 酵母提取物， 10 g 蛋白胨，溶于 350 mL 蒸馏水中，高压灭菌 20 min，然后冷却至室温，再加入 50 mL 10YNB 、 1 mL 500B 、 50 mL 10M 、 50 mL 1 mol/L K3PO4（ pH ），最后 4 ℃ 保存备用。 （ 3） SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳溶液的配制 6 ①30 % 凝胶储液：称取 g Acr， g Bis，加 100 mL 蒸馏水溶解。 ② 分离胶缓冲液：称取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸馏水溶解。 ③ 浓缩胶缓冲液：称取 g Tris， 48 mL 1 mol/L HCl，加 100 mL 蒸馏水溶解。 ④ 电极缓冲液：称取 g SDS， 9 g Tris， g 甘氨酸，加 1500 mL蒸馏水溶解。 ⑤1 mol/L 、 pH TrisHCl 缓冲液：称取 g Tris，加 800 mL 蒸馏水溶解 ， 再加 70 mL 1 mol/L HCl，混匀后 调节 pH 至 ，最后加蒸馏水定容至1000 mL。 ⑥ 样品缓冲液：取 1 mL TrisHCl 缓冲液， g SDS， g 溴酚蓝， 2 mL甘油， mL β 巯基乙醇，加 10 mL 蒸馏水溶解。 ⑦10 % 过硫酸铵：称取 1 g 过硫酸铵，加 10 mL 蒸馏水溶解（现用现配）。 ⑧ 固定液：取 45 mL 95%乙醇， 10 mL 冰醋酸，加 100 mL 蒸馏水。 ⑨ 染色液：称取 g 考马斯亮蓝 R250，加入 135 mL 95%乙醇， 30 mL冰醋酸，加 300 mL 蒸馏水，混匀，用滤纸过 滤。 ⑩ 脱色液：取 70 mL 冰醋酸， 200 mL 乙醇，加 1000 mL 蒸馏水。 （ 4）胶体几丁质的制备 ① 称取 10 g 片状几丁质（剪碎）置于 500 mL 三角瓶中，加 100 mL 浓盐酸浸泡，然后放入 37 ℃ 摇床中至几丁质完全溶解， 4 ℃ 过夜。 ② 向溶液中加入 500 mL 50 % 乙醇，不断搅拌至析出胶体，然后 5000 r/min离心 5 min，弃掉上清液。 ③ 在胶体中再加蒸馏水，搅拌后 5000 r/min 离心 5 min，重复上述过程至pH 约为。 （ 5） DNS 的制备 ① 取 g DNS， 加 500 mL 水， 45 ℃ 水浴溶解。 ② 逐步加入 NaOH 溶液（ 20 g 溶于水），不断搅拌至溶液清澈透明。 ③ 然后加入 91 g 酒石酸钾钠， g 苯酚和 g 无水亚硫酸钠。 ④45 ℃ 水浴，同时加水不断搅拌至全溶。 7 ⑤ 停止加热，冷却至室温，用水定容至 1000 mL。 ⑥ 将液体储存于棕色瓶，避光保存 7 d， 备 用。 （ 6）广泛 pH缓冲液 称取 g 柠檬酸 、 g 磷酸二氢钾 、 g 硼酸 、 g 巴比妥 ， 加 1 L 蒸馏水溶解。 主要仪器设备 Anke DL5B低速大容量离心机， Anke TGL16C 高速台式离心机， 恒温水浴锅，双层全温摇床（上海福玛实验设备有限公司）， UV20xx 紫外可见分光光度计， DYY12 型电脑三恒多用电泳仪 、 WD9412A 型恒温循环器、 WD9405A 型脱色摇床 （北京市六一仪器厂），夹心式垂直板电泳槽。 实验方法 酵母工程菌的培养和几丁质酶的诱导分泌表达 （ 1）挑取 GStachit1K 单菌落，接种到含 25 mL BMGY 培养基的 250 mL摇瓶中，用纱布封口，放到摇床中， 28 ℃ 、 130 r/min 振荡培养 3 d 至对数生长期（ OD600为 26）。 （ 2）将 BMGY 培养 物 以 5000 r/min 离心 1015 min，回收酵母细胞，弃掉上清液，将细胞重悬于 BMMY 培养基中 ，至 OD600值为 （ 约 100~200 ml）。 （ 3） 将培养液置于 500 mL 摇瓶中， 用 双层 纱布封口，在摇床中 2830 ℃继续培养并开始诱导表达（注意温度不要超过 30 ℃ ）。 （ 4） 诱导开始后，每天补加 100 % 甲醇使终浓度维持在 %。 （ 5） 诱导开始后，每天取样一次，直至第 7 天。 每次取样 3 mL 于 mL离心管中 20 ℃ 保存。 样品用于制作产酶曲线和蛋白电泳。 N乙酰氨基葡萄糖（ NAG）标准曲线的建立 表 1 NAG 浓度的配制 Tab. 1 Standard curve of NAG 项目 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 NAG 标准液（ mL） NAG 的量（ mg） 蒸馏水（ mL） DNS（ mL） ① 配制 1 g/mL N乙酰氨基葡萄糖 （ NAG） 溶液。 8 ② 取 11 支 25 mL 按 (表 1)加入试剂，将各管混匀，沸水浴煮沸 10 min。 ③ 取出后立即用冷水冷却至室温，再向每试管加入 3 mL 蒸馏水，混匀。 ④ 测 540 nm 处的吸光值， 以蒸馏水为空白调零，每组 3 个重复。 ⑤ 以 NAG 浓度（ mg/mL）为横坐标， OD 值为纵坐标，绘制出标准曲线。 酵母工程菌产酶曲线的测定 将保存的 粗酶液样品取出，几丁质酶活性测定参照 Antoni 和 Masarus 方法[6,7]， 并加以改进。 1 mL 胶体几丁质与稀释的 mL 酶液放于 50 ℃ 水浴保温 1 h， 上清液中的还原糖 采用 DNS 法测定。 根据标准曲线 得出 还原糖的含量，然后计算酶活。 酶活性单位（ U）定义为：每分钟水解几丁质产生 1 mg 还原糖所需的酶蛋白量 [8]。 几丁质酶的分离纯化 粗酶液的制备 根据分析最佳收获时间为 7 d。 第 7 天 终止发酵 收集发酵液。 将发酵液 5000 r/min 离心 1015 min，收集上清液 即为粗酶液。 硫酸铵沉淀 向提取的粗酶液中加入固体硫酸铵至 80%饱和度， 冰 浴后过夜。 以 5000 r/min离心 15 min，收集沉淀。 用适量 50 mmol/mL pH TrisHCl 缓冲液溶解，并在 相同缓冲液中透析 23 d，取少量溶液加 BaCl2检测是否透析完全。 透析完全后，将透析液以 5000 r/min 离心 15 min，取上清液， 80℃ 保存。 几丁质酶的 SDSPAGE 检测 对纯化酶液和 17 d的粗酶液进行 SDSPAGE，测定 表观 几丁质酶的分子量。 （ 1）分离胶凝胶液与浓缩胶凝胶液的配制 ①12 % 分离胶凝胶液：取 mL 30 % 凝胶储液， mL 分离胶缓冲液， mL 10 % SDS， mL ddH2O， 30 μl 10 % 过硫酸铵， 30 μl TEMED ，混匀。 ②3 % 浓缩胶凝胶液：取 mL 30 % 凝胶储液， mL 浓缩胶缓冲液， μl 10 % SDS ， mL ddH2O， 15 μL 10 % 过硫酸铵， 10 μL TEMED ，混匀（现配现用）。 9 （ 2）电泳操作 [9] ① 按照顺序安装玻璃板，然后沿两板缝隙加入 15 % 融化的琼脂，待琼脂凝固后加入现配的 12 % 分离胶凝胶液，至胶面距低板边缘 3 cm 左右，然后用滴管在胶面上轻轻铺注 1 cm 水层，垂直放置胶板，室温下放置 30 min 待胶凝聚。 凝聚后用滤纸吸出胶面上的水。 ② 将 3 % 浓缩胶凝胶液迅速注入分离胶上层，使液面与低板边缘齐平，插入梳子。 室温下放置 2 h，待其完全凝聚。 凝聚后小心拔出梳子，在玻璃 板两侧倒入电极缓冲液。 ③ 将 17 d 的粗酶液离心，取 50 μL 上清再加入 50 μL 上 样缓冲液，对照组用提纯的酶液。 混匀后在沸水中煮 10 min，冷却后用微量加样器将 25 μL 样品和低分子量标准蛋白质分别注入加样孔中。 ④ 将电泳槽与电泳仪相连，电压保持 100 V 进行电泳，至样品迁移至玻璃板下端 1 cm 时停止电泳。 （ 3）染色及脱色 ① 将电泳完毕的凝胶取出，用去离子水冲洗，然后放到考马斯亮蓝 R250染色液中染色，过夜。 ②弃去染色液，凝胶冲洗后置于固定液中固定。 ③ 将凝胶置于 500 mL 脱色液中脱色， 至 胶脱 色完全。 ④ 脱色后，将胶板置于去离子水中室温下保存。 （ 4） 分子量测定 已知 标准分子量蛋白质（低）各电泳条带的分子量，通过电泳图估计几丁质酶的分子量 [10]。 几丁质酶 的酶学性质 几丁质酶反应的最适温度 将 酶反应体系 分别置于 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 、 55 ℃ 、 60 ℃ 、65 ℃ 、 70 ℃ 、 75 ℃ 和 80 ℃ 下反应 1 h， DNS 法检测几丁质酶的活性，确定酶反应的最适温度。 最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同温度条件下几丁质酶的相对酶活性（即在不同温度下 的酶活性占最高酶活性的百分比）。 几丁质酶反应的最适 pH 值 10 用广泛 pH缓冲液将酶反应体系 pH 值调为 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 测定几丁质酶活性。 将最高的酶活力定义为 100 ％，分别计算不同 pH 值条件下几丁质酶的相对酶活性（方法同上）。 几丁质酶的 热稳定性 先将酶液分别置于 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 、 45 ℃ 、 50 ℃ 和 55 ℃ 下保温不同的时间（ 10 min、 20 min、 30 min、 40 min、 50 min、 60min）后，立即在 0 ℃冰浴中冷却，然后加入几丁质在 50 ℃ 反应 1 h ，测定几丁质酶活性，以剩余的酶活性作为酶的热稳定性的指标。 将最高的酶活力定义为 100％，分别计算不同温度条件下几丁质酶的相对酶活性。 几丁质酶的 pH 值稳定性 将酶液分别在 pH 、 、 、 、 、 、 、 、 、 、 的缓冲液中 处理 1 h 后，然后再将反应体系的 pH值调至 ，测定剩余的酶活性。 将最高的酶活力定义为 100％，分别计算不 同 pH 值条件下几丁质酶的相对酶活性。 不同金属离子对酶活性的影响 在几丁质酶反应体系中加入不同的金属离子（ Cu2+、 Ca2+、 Mn2+、 Fe2+、 Zn2+、Ba2+、 K+、 Na+、 Ag+、 Mg2+、 NH4+ 、 Hg+）并使其最终浓度为 mol/L，在 50 ℃下反应 1 h 后，以 反应体系 中 不加金属离子的酶活 性 为。