茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用项目可行性研究报告(编辑修改稿)

茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用项目可行性研究报告(编辑修改稿)内容摘要：

合防治技术进行研究，达到有效预防、控制和减少青枯病害和降低蔬菜农药残留的目的，在减少对农业生产造成的损失的同时保障人民生活健康。 茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用 5 三、国内外相关技术发展概况和趋势 （一）青枯病研究进展 1．植物青枯病的症 状 植物青枯病是由青枯雷尔氏菌引起的土传病害。 青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）侵害寄主（特别是茄科寄主）后，寄主植物（如番茄、辣椒、茄子等）在发病时出现青枯症状，即植物的叶子萎蔫下垂。 发病初期，部分叶子发生萎蔫，发病中期，大部分叶子在阳光下发生萎蔫，在早晚恢复正常，发病后期，萎蔫的叶子无法恢复。 青枯萎蔫作为青枯雷尔氏菌危害寄主植物的重要致害特征。 但近年来，田间也发现呈枯萎或萎蔫病状的青枯病植株， 1990 年在山东沂南县调查发现烟草枯萎的病株，分离到 5 个细菌菌株，经对各菌株致病性测定、格兰氏 染色反应、细菌形态、培养性状、生理生化测定和血清学反应的鉴定，结果表明：这５个菌株均属于青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）（郑继法等， 1990）。 在河南省上蔡县采集生姜萎蔫青枯病害姜块，分离测定结果表明，引起生姜萎蔫青枯病病原细菌的是青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）。 因而，青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）的不同致害特征，应根据受害寄主分离细菌的鉴定确定原因。 2． 青枯雷尔氏菌的形态特征 电镜下观察 ，青枯雷尔氏菌（ Ralstonia solanacearum）（ Smith， 1896）的基本形态为椭圆形至长椭圆形，革兰氏染色为阴性，菌体大小为 ～ ～ 微米，两极着色较深，不同作物上分离的青枯雷尔氏菌形态的大小、宽长比差异很大。 极生鞭毛 1～ 4 根。 电镜 4 万倍， 大小， 宽长比 电镜 4 万倍， 大小，宽长比 电镜 5 万倍下显示了荚膜构造。 图 4 青枯病 的为害症状 茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用 6 青枯雷尔氏菌菌落形态 番茄青枯病 电镜 1 万倍下显示鞭毛 青枯雷尔氏菌菌株显微照片 图 5 青枯雷尔氏菌的形态特征 3．青枯病发病规律和侵染循环 青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）生长极限温度为 10～ 41℃ ，最适温度为 30～ 37℃ ，病菌发生与土壤的温度、含水量和酸碱度密切相关，当土壤温度为 22～ 27℃ ，含水量超过 25%，氢离子浓度 nmol/L （ ）时，发病最重，因此高温、高湿易诱发青枯病。 此外，植株幼苗生长不壮，多年连作，中耕伤根，低洼积水，土壤偏酸等，均可促进发病，加重为害。 由于 青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）在土壤中存活时间长、传播快，用药剂防治不能有效地控制病害虫的发生，导致连作区烟草发病更严重，减产高达 60%以上，甚至失收。 青枯雷尔氏菌（ R. solanacearum）在一般条件下是从植株根部伤口侵入，但不能从植物气孔侵入。 温室试验证明，把植株的根用消毒刀弄伤后立即接种，植株感病受害严重，而 24 小时后再接种植株几乎不受伤害。 幼苗移栽时造成的根部伤口比成苗伤口更易引起青枯雷尔氏菌侵入。 接种量大时，就是没有伤口，此菌也能侵入，一般是从次生根萌发处或根毛与皮层连接处侵 入，侵入率较低。 病菌进入寄主组织后即可繁殖，并进入维管束，继续向其他组织扩展蔓延，同时分泌果胶酶、纤维素毒等，分解寄主的中胶层，使寄主皮层和髓部组织残废腐烂。 寄主组织破坏腐烂后，病菌落入土壤中或堆肥中越冬，来年碰到有利条件，继续侵入寄主为害。 4．植物青枯病的生物防治研究进展 （ 1）无致病力青枯雷尔氏菌的利用 从 80 年代初开始，用无致病力青枯雷尔氏菌菌株防治植物青枯病在国内外青枯病的生物防治研究和应用方面投入人力最多，发表论文最多。 用无致病力产细菌素的青枯雷尔氏菌（ ABPS） 121 菌株、日 本 Tanaka 等用 ABPSM4S 菌株及其噬菌体、日本的 Hara 和 Ono 用 ABPS OM2 菌株、朝鲜Yi 用 ABPS Y611 菌株防治烟草青枯病，任欣正等用 ABPS 菌株 MA7 和 nOE104 防治番茄青枯病，均取得温室或小区试验的良好的防效，但后期防效降低，大田试验尚未取得成功，这可能性主要由于 ABPS 菌株在大田土壤中不能大量繁殖，缺乏与其它微生物的竞争力所致。 郑继法等研究了烟草细菌性青枯雷尔氏菌的无毒产细菌素菌株对烟草青枯雷尔氏菌 411 的防治作用。 结果指出：用浸根图 6 青枯病 原菌 侵染循环 茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用 7 法处理 A35， A43， A14 三个无毒 菌株对致病菌 411 均有防治效果。 其中 A35 防效最好，病毒情指数比治作用，病情指数比对照降低达 80%，推迟发病 25 天，说明在烟草根际保持较高数量的 A35，是提高其防治效果的必要条件。 （ 2）芽孢杆菌的利用 Bacillus 、易保存、有效期长等特性，较之其它生防菌更受到厂家和商家的青睐。 用于防治青枯病试验的芽孢杆菌有：多粘芽孢杆菌 FU6（ Bacillus polymyxa）（ Aspiras et al., 1985）、枯草芽孢杆菌（ B. subtilis）（ Phae et al., 1993）、凝固芽孢杆菌 BA24 (B. coagulans)、蜡状芽孢杆菌BA3 （ B. cereus）（ Silveira et al., 1995）、巨大芽孢杆菌 B1301（ B. megaterium）等。 刘波等从番茄病株筛选到青枯病生防菌 ANTI8098 菌株，对番茄青枯病有较好的防效，经农业部药检所指定的田间药效测定表明：对茄子青枯病的防效在 7585%，菌株经德国菌种保存中心（ DSMZ）鉴定为蜡状芽孢杆菌（ Bacillus cereus， strain ANTI8098A，鉴定号： ID011000），并对番茄青枯病菌的致病力分化以及生防菌形态特征、生化特性、培养特性、抑菌机理、生产工艺、生物测定、大田试验进行了研究。 印度 Aunratha 和 Gnanamanickam（ 1990）用 Bacillus 和 B36菌株防治香蕉、茄子和番茄青枯病，分别取得了温室试验 50%、 61%和 95%，田间试验 50%、 49%和 36%的防效，同时植株鲜重和生物产值也得到提高。 试验防效在 4595%。 （ 3）链霉菌的利用 自然界 70%以上的抗生素由 Strepromyces ，所以很自然就有人将此类菌直接用于病害的生防。 Elabyard 等（ 1993）交替使用链霉菌菌株－灰白链霉菌（ Strepromyces canescens）、柠檬荧光链霉菌（ Strepromyces citreco fluorescens）和极美链霉菌（ Strepromyces pulcher）分别制成种衣剂处理番茄种子，可在 4263 天内控制 R. solanaceans 造成的青枯病。 （ 4）假单胞杆菌的利用 通过分析研究，番茄青枯雷尔氏菌的拮抗菌多数属于荧光假单孢菌属。 经多次分离 筛选，从土壤中分离出了对作物无不良影响而对番茄青枯雷尔氏菌有拮抗作用的菌株 104 个。 经试验，利用这种拮抗菌防治番茄青枯病，当发病株率在 25%以下时，防治效果可达 100%；当发病株率达 45%时，防治效果为 50%左右。 （ 5）菌根真菌的利用 菌根真菌由于一部分在根外，一部分在根内，而占有独特的生态位。 它们从寄主得到营养成分供应，这一优势使它在与根系更紧密的联系中，获得更大的更有功能的总生物量，并以此增加对植物的作用（与仅限于根际的其它微生物相比）。 因此菌根真菌作为根际群落的组成，其重要作用受到越来越广泛 的承认。 有些人亦捷足先登，将之用于植物病害的生物防治。 印度 Suresh 和 Rai（ 1991）发现受泡囊丛枝状菌（ VAM）感染的番茄根围菌根提取物可抑制。 在菲律宾的一项研究中，发现一种菌根可减弱番茄细菌性青枯病的严重程度（ Hayward， 1991）。 VAM 的作用可能是建立了一种机械屏障，阻止病原细菌进入寄主组织。 （ 6）青枯拮抗菌的利用 黎定军等（ 1997）对来自湖南嘉禾、郴县、永州、永兴、桂阳和湘西等 23 个烟区青枯病发病较轻的烟地根际土壤进行了室内细菌分离，获得 317 个菌株。 测定了这些菌株对青枯雷尔氏菌拮抗性，筛选出有明显抑菌作用的菌株 48 个，其中最有效的拮抗菌株 10 个。 对该 10 个菌株相互之间的拮抗性测定结果表明，有６个菌株相互之间无拮抗作用，可在烟草青枯病的生物防治中应用。 郭坚华等（ 1996）利用抑菌圈 定殖力双重测定法成功地筛选了青枯病生防细菌，该研究首先用平皿抑菌圈法，筛选出 55 个拮抗青枯雷尔氏菌的细菌菌株，将番茄幼苗在各菌菌悬液中浸根 12ｈ后，栽种于温室未灭菌的土壤中，结果发现：有 22 个菌株在幼苗根部的定殖能力较强（终定殖密度大于 104cfu/g 根）， 茄科土传病害生物防治拮抗菌剂生产工艺关键技术的研究与应用 8 其中革兰氏 阴性土壤细菌占同类菌的 ％，革兰氏阳性土壤细菌占同类菌的 ％，其中有 17 个拮抗菌菌株在番茄幼苗根部的定殖密度超过所有致病菌。 丁爱云等（ 1999）从山东滕州、临沂等县（市）的烟草、番茄和辣椒根际采集土壤样本 15 份，经内分离纯化获得细菌 102 株、放线菌 55 株。 以烟草赤星病菌、野火病菌和青枯雷尔氏菌等为对象，对 157 个菌株进行平板对峙培养法抑菌测定，分别筛选出有拮抗活性的细菌 33 株和放线菌 22 株。 郑福庆等（ 1998）从广东省不同地方、不同作物的根围及根际土壤中，筛选到对番茄青枯病病菌具抑菌效果的菌株 20 个，盆栽试验表明，这些菌株可推迟番茄青枯病发生 1035 天，防治效果高达 80%。 （ 7）基因工程生防菌的利用 中国农科院植保所康耀卫等采用转座子 Tn5 诱变 R. solanacearum，获得了世界首例植物青枯雷尔氏菌胞外蛋白输出缺失突变体（简称 eep 突变体）。 该突变体在缺失了多种胞外蛋白外输功能后，也失去了对寄主的致病力。 eep 突变体接种到植物体内后，在局部范围内有一定的定殖能力。 温室和田间小区生防试验中，该突变体在 30 天以内有一定防治效果。 虽然防效不甚理想，但在理论上该项研究代表 了一个新的发展方向。 而且，当 eep 突变体经过改造后，完全有可能进入大田实际应用。 法国 Trigalet 和 Demery 发现有 6 个 Tn5 诱变产生的无致病力青枯突变株，它们能在番茄茎、叶部定殖，它们与强致病菌株以等量或低量接种时，可阻止致病菌的增殖，具有较好的生防前景。 Frey等也得到了相似的结果。 （ 8） 植物青枯病的 生防菌剂 研究 关于青枯生防菌的生产工艺探索和研究，国内外研究者通过改进生产工艺，如营养配方、通气状态等，来提高生防菌的发酵水平，来提高生防菌的防治效果。 关于青枯生防菌土壤存活基质配方研究，台湾 黄振义和孙守恭教授年发现向土壤中施用一种名为 SH 有机无机复合的添加物，能提高土壤中微生物含量，有效地防治和减轻青枯病害。 将这种混合物做为基质，填充于研究的生防菌剂中，施用后可有利于生防菌在土地中生存繁殖，试验结果表明，用后 7 天土壤生防菌仍有施用时的70%以上，防效增加 7%。 但由于该混合物是农副产品，营养含量低、体积大，是它最大的不足之处，所以变成填充剂、做成活性基质将会影响制剂的效价，会影响生防菌的使用，生防菌存活基质有待于进一步的研究。 （二）枯萎病研究现状 1．枯萎病的发生与危害 枯萎病 原 枯萎病是一类植物病害的总称，因病原菌的侵害，造成植物枯死萎蔫．枯萎病有细菌性病原（如香蕉细菌性枯萎病等 [1]）和真菌性病原两种 [2]．本文所指的枯萎病为真菌性病原，是由镰刀菌属真菌寄生引起的一种世界性的真菌土传病害 [3]，其中尖孢镰刀菌 (Fusarium oxysporum Schl.)是主要病菌种类之一．尖孢镰刀菌属 半知菌类（ Fungiimperfecti）、梗孢目（ Moniliales）、痤孢科（ Tubercular）、镰刀菌属（ Fusarium）．自从 Snyder 和 Hansen（ 1940）把镰刀 菌属美丽组内的种合并为 1 个，成为尖孢镰刀菌（ F. oxysporum） [4]． 寄主范围 （ 1）经济作物：棉花、油桐、蓖麻、亚麻等 [5,6]．（ 2）茄科作物：番茄、胡椒、茄子、烟草、马铃薯等 [7,8]．（ 3）瓜类作物：黄瓜、节瓜、冬瓜、西瓜、南瓜、西葫芦、甜瓜、丝瓜、白瓜、越瓜、苦瓜、葫芦瓜、哈密瓜等 [9]．（ 4）豆科作物：大豆、四季豆、豇豆、猪屎豆、豌豆等 [10]．（ 5）花卉植物：康乃馨、郁金香、鱼尾菊、非洲菊、鸢尾、水仙、翠菊、合欢、百合、仙人掌、穿。