山羊褪黑激素受体1a基因hinfⅰ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析_本科毕业论文(编辑修改稿)

山羊褪黑激素受体1a基因hinfⅰ酶切多态性及其与产羔数性状的关联分析_本科毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

紫外分析仪 UVIV 北京市新科技应用研究所 电泳槽 DYYIII 北京六一仪器厂 稳压稳流电泳议 DYY2 北京六一仪器厂 手提式高压灭菌锅 YXQSG46280A 上海博讯实业有限公司医疗设备厂 超纯水仪 WaterPro 美国 LABCONCO 公司 移液器 1ml； 200μl ； 40μl ； 10μl ； 芬兰 Labsystems 公司 主要试剂的配置 1) 1M ： 称取 Tris碱溶于 800ml双蒸水中，加浓盐酸调至pH=，定容到 1000ml。 高压灭菌，室温保存 ； 2) EDTA（ pH=） ： 称取 Na2EDTA2H 2O溶于 800ml双蒸水中，加入NaOH（约 20g）调至 pH=，定容到 1000ml。 高压灭菌，室温保存 ； 3) 10%SDS： 称取 50g SDS加热溶于 400ml双蒸水中，定容至 500ml。 高压灭菌，室温保存 ； 4) 抗凝剂（ ） ： 量取 200ml EDTA加入双蒸水定容至 500ml。 用于基因组 DNA提取的溶液的配制 1) 蛋白酶 K： 称取 200mg蛋白酶 K溶于 10ml双蒸水，以 1ml分装， 20℃ 冷冻保存 ； 2) 氯仿 /异戊醇（ 24:1） ： 量取 480ml氯仿，加入 20ml异戊醇，混匀 ； 3) 3M NaAc： 称取 NaAc3H 2O溶于 400ml双蒸水中，用 HAc调至 pH=，加水定容华中农业大学本科毕业论文（或设计） 9 至 500ml。 高压灭菌，室温保存 ； 4) TE缓冲液 ： 100mM Triscl （ pH＝ ） ， 1mM EDTA（ pH＝ ）。 用于琼脂糖凝胶电泳及检测溶液的配制 1) 50TAE 储备液 ： 称取 242g Tris碱溶于 750ml双蒸水中，加入 HAc、100ml EDTA（ pH＝ ），加水定容至 1000ml； 2) 5TBE 储备液 ： 称取 54g Tris碱和 750ml双蒸水中，加入 20ml EDTA（ pH＝ ），加水定容至 1000ml； 3) 6 上样缓冲液 ： %溴酚兰， %二甲苯青， 15%Ficoll聚蔗糖 ； 4) 溴化乙锭（ EB， 10mg/ml） :100ml双蒸水中加入 EB，搅拌使完全溶解，转入棕色试剂瓶，锡箔包裹。 用于聚丙 烯 酰胺凝胶电泳和银染的溶液的配制 1) 30% 丙 烯 酰胺（丙 烯 酰胺 :甲叉双丙 烯 酰胺＝ 29:1） :700ml双蒸水中加入 290g丙 烯 酰胺， 10g甲叉双丙 烯 酰胺，搅拌使完全溶解，加水定容至 1000ml， 4℃保存 ； 2) 10% 过硫酸铵 ： 称取 1g过硫酸铵溶于 8ml双蒸水，定容至 10ml； 3) 10% 乙醇 ： 量取 50ml无水乙醇溶 于 450ml水中，混匀 ； 4) 1% HNO3： 量取 15ml浓 HNO3溶于 985ml双蒸水中，混匀 ； 5) % AgNO3： 称取 1g AgNO3溶于 500ml双蒸水中，置于棕色试剂瓶 ； 6) 3% Na2CO3（ %甲醛） ： 称取 30g无水 Na2CO3溶于 900ml双蒸水中，加入 甲醛，定容至 1000ml； 7) 3% HAc： 量取 30ml冰 HAc溶于 970ml双蒸水，混匀。 方法 DNA 的提取 从山羊颈静脉采血 10ml，放入装有抗凝剂（ ）的离心管中，6000r/min离心 15min，弃上清，吸取白细胞沉淀（参杂少量红细胞）于另一离心管中；加入两倍体积双蒸馏水（灭菌），摇匀沉淀，静置 10min～ 15min，破碎红细胞； 6000r/min离心 15min，轻轻弃去上清，留白细胞沉淀；加入 1SET 5ml，蛋白酶 K（ 10mg/ml） 200ng/ml， 10% SDS 250μl 至终浓度 %，55℃ 水浴消化过夜；加入等体积饱和平衡酚轻轻摇匀， 120xxr/min离心 15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下相苯酚；重复上 步；加入等体积苯酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1），轻轻摇动 10min， 120xxr/min离心 15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层有机相；加入等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1），轻轻摇动 10min， 120xxr/min离心 15min，轻轻吸取上层水相于另一离心管中，弃下层华中农业大学本科毕业论文（或设计） 10 有机相；加入两倍体积预冷无水乙醇，轻轻转动管子， DNA呈絮状析出，用 1ml吸头（灭菌）吸出 DNA沉淀，放入 ，加入预冷无水乙醇洗涤一次，离心弃去无水乙醇，再用 75%乙醇漂洗 2次，小心吸去乙醇，待 DNA沉淀自然干燥后，加入适量 TE（ 100μl ～ 300μl ）溶解。 引物 参考滑国华等（ 20xx）进行设计，序列如下： 上游引物 : 5’ ACGACCCGAGGATCTATTCC 3’ 下游引物 : 5’ ATATAAGTCCTGGGGCTTCAGATT 3’， 在下游引物中引入错配碱基 A，当突变位点为 G（即反义链为 C）时，可形成 HinfⅠ（ GATTC）酶切位点；当突变位点为 A（即反义链为 T）时，该酶切位点缺失，由此可进行基因型判定。 扩增及其电泳检测 PCR扩增 反应体系 （ 表 2） 表 2 PCR 扩增反应体系 （ 20μ l） Table 2 PCR amplification of the response system （ 20μ l） 反应体系 response system 反应体积 V（μ l） response volume（μ l） 灭菌蒸馏水 10 Buffer 2 Mg2+ dNTP 上游引物 下游引物 Taq DNA 聚合酶（ 5 U/ml） 模板 DNA 1 Total 20 退 火温度的优化 利用 PCR 机器上都有一个 Gradient 功能，在一次 PCR 过程中，对机器中不同位点的反应采用不同的退火温度，一般在第一次实验中，采用引物溶点上下华中农业大学本科毕业论文（或设计） 11 10 度设置退火温度 梯度。 每 个温度梯度 一个反应，最后电泳 检测并 比较 各个 退火温度 的条带效果， 得到最好结果。 本试验中退火温度设定为 55－ 65℃，结果表明，退火温度 60℃时，无非特异性带，目的条带最为清晰。 PCR 反应程序 （表 3） 表 3 PCR 反应程序 Table 3 PCR amplification of the response term 步骤 steps PCR 反应条件 PCR reaction conditions 温度 temperature 时间 time 1 预变性 95℃ 5min 2C 变性 95℃ 30sec 3C 退火 60℃ 30sec 4C 延伸 72℃ 30sec 5 延伸 72℃ 7min 6 保温 16℃ 10min 第二步至第四步循环 35 次。 琼脂糖凝胶电泳检测 PCR 扩增产物用 %琼脂糖凝胶电泳检测， EB 染色，利用 BIORAD 凝胶成相系统 凝胶成像系统进行成像分析，记录结果并拍照。 琼脂糖凝胶电泳方法 （ 1） 灌胶 将透明胶带粘于灌胶模槽的两端，制成灌胶模。 放入梳子。 将模放于水平台上。 取一烧杯，放入： 琼脂糖 g； 1T AE 50 ml。 混匀，加热，至琼脂糖彻底溶解。 待稍冷后，加入 5ul 饱和的溴乙锭，。