基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文(编辑修改稿)

基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 5 图 12 本论文设计流程 Fig. 12 The design process of the thesis 主要内容 本论文主要从以下几个方面对课题进行研究： （ 1）通过单因素实验确定 Bacillus licheniformis X47 的最佳酶解条件和最佳融合条件； （ 2）利用基因重排技术筛选角蛋白酶活力高的菌株。 四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 6 第二章 材料与方法 实验材料 菌种 地衣芽孢杆菌， Bacillus licheniformis X47，由本实验室分离与鉴定 [37]。 药品与试剂 干酪素， Sigma 公司； 葡萄糖，成都科龙化工有限公司； 牛肉膏，北京奥博星生物有限公司； L天冬酰胺，上海博奥生物有限公司； 溶菌酶， Lysozyme（ Egg White）， BIOSHARP； 脱脂羊毛 ：将制革废羊毛反复清洗，加入 1%脱脂剂以及 1%脱脂酶脱脂 12 h后乙醇浸泡一天，充分水洗后 30 ℃ 干燥，用剪刀将其剪到 1 mm的碎段备用。 Folin 甲试剂： 溶液 1，称取 g CuSO45H2O 和 g Na3C6H5O7（ H2O），溶解于 100 mL 去离子水；溶液 2，称取 gNa2CO3 和 4gNaOH，溶解于 1 L去离子水； 溶液 1 和溶液 2 以 1 : 50 的比例混合均匀。 Folin 乙试剂：称取 100 g钨酸钠（ NaWO2 2H2O）和 25 g钼酸钠（ Na2MOO4  2H2O）置 20xx mL磨口回流装置内，加 700 mL 蒸馏水和 100 mL浓盐酸。 小火加热，回流 10 h，再加入 150 g硫酸锂（ Li2SO4H 2O）， 50 mL蒸馏水及数滴液溴。 在通风橱中开口煮沸 15 min，冷却后定容至 1000 mL。 然后 1:1 与去离子水混合均匀。 置棕色瓶中，可在冰箱长期保存。 聚乙二醇 PEG 溶液： PEG6000 用高渗溶液配制； 300 g/L PEG： 3 g PEG6000 溶解于10 ml SMM， ； 400 g/L PEG： 4 g PEG6000 溶解于 10 mL SMM， ， ， ， ； 500 g/L PEG： 5 g PEG6000 溶解于 10 mL SMM， ； MPa灭菌 30 min； 高渗溶液 (SMM)： MgCl2 mol/L；顺丁烯二酸 mol/L；蔗糖 mol/L。 以双蒸水配制， pH 调至 ， ~ MPa 灭菌 30 min； 溶菌酶溶液：使用前，称取一定量的溶菌酶用高渗溶液配置，使溶菌酶的浓度达到 mg/mL ， mg/mL， mg/mL， mg/mL，并经过 μm的无菌过滤器过滤； 新生磷酸钙：分别配置 1 mol/L CaCl2 溶液和 mol/L K2HPO4 溶液， ~ MPa灭菌 30 min，使用时等体积混合； 其它试剂为分析纯。 四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 7 培养基 种子培养基 (g/100 mL)：葡萄糖 g， K2HPO4 g， L天冬酰胺 g， 牛肉膏 g， NaCl 4 g ， pH。 筛选培养基 (g/100mL)：干酪素 g，牛肉膏 ，蛋白胨 1g， NaCl 6 g，琼脂 g， 保藏培养基 (g/100mL)：牛肉膏 ，蛋白胨 1g， NaC l6 g ，琼脂 g， 发酵培养基 (g/100mL)：可溶性淀粉 4 g，黄豆粉 g， K2HPO4 g， L天冬酰胺 g， NaCl 4 g，脱脂羊毛 g， pH。 主要仪器设备 Cover015 光学显微镜 OLYMPUS 公司 日本； SWCJ2FD 型净化工作台 苏州净化设备有限公司； DHP9082 电热恒温培养箱 上海一恒实验仪器有限公司； HZSH 超级恒温水浴锅 哈尔滨市东联电子； GL20G II型 高速冷冻离心机 上海安亭科学仪器厂； 2112 恒温摇床 上海福玛实验设备有限公司； 旋转蒸发水浴锅 上海亚荣生化仪器设备有限公司； TGL/16M 冷冻离心机 长沙湘麓有限公司； 722S 型光光度仪 PE 美国； Sartorius 分析天平 北京赛多利斯天平公司； DHG9070A 型干燥箱 上海精宏 实验设备有限公司； 实验方法 角蛋白酶活力分析方法 采用 Lowry法测定角蛋白酶活力。 酶活力标准曲线的绘制 标准曲线的绘制见附录 1。 角蛋白酶活力测定 加入 4 mL mol/L GlyNaOH 缓冲液和脱脂羊毛 g，再加入待测酶液 1 ml。 60 ℃ 培养 30 min，加入 1 mL 20 %TCA 溶液以终止反应，空白对照组在加入酶液同时加入 1ml 20 %TCA 溶液。 然后室温静置 60 min后过滤掉不溶物，吸取 1 mL上 清四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 8 液，采用 Lowry法检测其蛋白质的含量。 加入 5 mL Folin甲试剂，混匀在室温下放置 510 min；加入 1:1 稀释的 mL Folin 乙试剂，立即混匀后于 25 ℃ 条件下水浴 25 min, 取出测定清液在波长 750nm 条件下的吸光度 ， 然后与标准曲线对照测得角蛋白酶活力 . 角蛋白酶活力的定义： 1 mL酶液每 30 min 释放 1 μg蛋白质（以牛血清为标准蛋白质进行折算）为一个活力单位（ U）。 原生质体的制备和再生 将实验室保存的地衣芽孢杆菌， Bacillus licheniformis X47 接种到斜面培养基活化 12 h，再接种到种子培养基，于温度 ℃ ，转速 180 rpm再次培养 24 h，然后按 6 %的接种量接种到种子培养基中培养至 OD值为 时停止， 立即取下摇床 ， 5000 rpm 下离心 8 min，弃上清液。 同样条件用生理盐水洗涤 2 次，高渗 SMM 溶液洗涤 1 次，最后用高渗SMM 溶液等体积悬浮，制成的菌悬液，取适量菌液稀释进行活菌计数 X。 取适量高渗菌体悬浮液于小三角瓶中，加入溶菌酶酶解，水浴低速震荡。 酶解后立即离心，弃去上清液，用高渗溶液洗涤一次，最后悬浮于等体积的高渗溶液中。 其中，溶菌酶浓度设置为 mg/mL， mg/mL， mg/mL, mg/mL；酶解时间设置为 10min， 20min， 30min， 60min， 120min；酶解温度设置为 25℃ ， 30℃ ， 35℃ ， 40℃ ，50℃。 用高渗溶液和生理盐水稀释进行活菌计数。 生理盐水为 Y，高渗溶液为 Z。 原生质体形成率（ %） 原生质体再生率（ %） X：处理前菌落数； Y：未被酶解的菌落数； Z：再生原生质体数和未被酶解的细菌数 原生质体的灭活 将制备好的原生质体进行紫外灭活，其处理方式为菌液悬浮在平皿中 于紫外灯下照射20 min。 灭活处理后适当稀释，涂平板进行活菌计数，在 37 ℃ 培养箱培养，计算原生质体灭活率。 原生质体的融合及其条件优化 取灭活后亲本原生质体 1 mL液体，转速 3800 rpm，离心 20 min，去掉上清液，加入制备好的 mL 新生磷酸钙溶液，混和均匀，再加入 mL PEG 6000溶液，不同的温度下作用不同的时间，之后用高渗 SMM溶液将其稀释， 3800 rpm， 20 min离心，去掉上清液，再用高渗 SMM溶液定容到 1 mL，混和均匀后稀释涂布计数。 其中，选择优化的 融合温度为 25 ℃ 、 30 ℃ 、 35 ℃ 、 40 ℃ 和 45 ℃ ，选择优化的融四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 9 合时间为 5 min、 10 min、 15 min、 20 min和 25 min，选择优化的 PEG浓度为 300、 400、 500 g/L，选择优化的融合 pH为 、 、 、。 融合子的检出 首先在再生培养基平板上挑选四周拥有透明圈的菌落，接种到保存培养基斜面上。 取得一定量的斜面后，进行融合子初筛： 分别从斜面试管中挑取一环菌体接种于盛有 50 mL发酵培养基的 250 mL的三角瓶中，置于恒温摇床中 37 ℃ ， 180 rpm条件下培养 72h，然后将发酵液 离心（ 4 ℃ ，10000 rpm） 5 min，取上清液测定角蛋白酶活力。 将初筛得到的产酶活力较高的菌株进行复筛。 复筛过程与初筛相同。 四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 10 第三章 结果与讨论 最适菌龄的确定 由于实验菌种长期保存，可能已经衰老退化，通过前期试验的观察，需要经过 24 小时复壮，然后把菌株接入种子培养基进行培养，得到地衣芽孢杆菌 B. licheniformis X47 的生长曲线图 21。 从图 21 中看出， 010 小时为该菌的对数生长期， 10 小时左右进入稳定期。 由于对数生长期的细菌细胞 壁肽聚糖极少，对细胞壁的酶解更易发生，因此我们进行原生质体的制备应该选取处于对数生长期的菌体。 由图 21 可以确定 B. licheniformis X47 的最适菌龄 为9 小时。 图 21 B. licheniformis X47 生长曲线 Fig. 21 The growth curves of B. licheniformis X47 酶解最佳条件的确定 选择地衣芽孢杆菌 B. licheniformis X47 为初始菌株，通过复壮培养，选择达到最适菌龄的菌体，通过溶菌酶酶解制备原生质体。 通过溶菌酶酶解条件（本实验优化溶菌酶浓度、酶解时间和酶解温度）对原生质体形成率和再生率的影响，确定最佳的酶解条件。 初始设置实验酶解浓度为 mg/mL，酶解时间为 30 min，酶解温度为 40 ℃。 四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 11 溶菌酶最佳浓度的确定 从图 22 可以看出原生质体的形成率随着酶解浓度上升而不断增加，在酶液浓度，形成率一直在增高，而到了 mg/mL以后，继续增大酶液浓度，形成率反而有部分下降。 原生质体再生率在酶液浓度 mg/mL到 mg/mL的范围内，整 体处于下降趋势，随着酶液浓度增高而下降，在 2 mg/mL 时，再生率下降明显，之后几乎处于 0%。 整体来说，原生质体的形成率随酶液浓度上升而增加，而再生率却越来越低。 在一定酶解时间和温度下，浓度过高的酶液会损坏细胞壁，导致其无法再生 [38]。 而且有报道称残留的细胞壁有利于细胞壁的快速生成，有助于融合菌体细胞壁的生成 [3940]。 因此，过高的酶液浓度虽然有利于原生质体的形成，却会导致细胞壁的再生收到阻碍，影响融合菌体细胞壁的再生。 终上所述，结合图 22 不同酶浓度下原生质体形成率和再生率，选择酶液浓度为，原生质体形成率为 96%，再生率为 %，使得原生体形成率较高，同时具有一定的再生能力。 图 22 酶解浓度对原生质体形成率和再生率的影响 Fig. 22 Effect of lysozyme concentration on formation rate and regeneration rate 最佳酶解时间的确定 如图 23 所示，在 10 到 30 分钟，原生质体的形成率上升明显，过了 30 分钟之后，形四川大学本科毕业论文 基于基因组重排技术的角蛋白酶高产菌株的筛选 12 成率部分下降。 而原生质体再生率随着时间的增加一直在下降，在 30 分钟时，下降明显。 从图中看来，原生质体的形成并不是随着时间增加不断增加，在 30 分钟时，形成率处于最高。 根据谭蓓英等的研究，保持部分残留细胞壁有利于细胞壁的快速生成。 30 分钟酶解时间下，原生质体形成率为 %，再生率为 %。 一定酶解时间内， 酶解的程度与酶解时间成正比，直到所有菌体被酶解为原生质体为止。 过长的酶解时间，会导致原生质体融合后细胞壁难以生成，降低原生质体的再生率，增强酶液中杂质对菌体的作用；而过短的酶解时间，导致原生质体形成率过低，原生质体形成不完全。 所以，确定最佳的酶解时间为 30 分钟。 图 23 酶解时间对原生质体形成率和再生率的影响 Fig. 23 Effect of lysozyme treate。