毕赤酵母植酸酶相关_毕业论文(编辑修改稿)

毕赤酵母植酸酶相关_毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

利用率 植酸酶在饲料和食品中的存在是不利于吸收和利用其中的矿物质元素的，包括锌，钙 ，镁，锰，铜等。 植酸与下列离子形成复合物的稳定性依次减弱： Zn2+的， Cu2+， Ni2+，本 科 毕 业 论 文 第 9 页 共 29 页 CO2+， Mn2+， Ca2+。 因此，植酸，影响最大的是锌矿物元素的利用率。 植酸的存在可降低主食植物性食物的人群对 Zn2+的吸收和稳态，可导致侏儒症和性腺功能低下症。 pH值是一个重要的因素，在低 pH 值的植酸溶解度的溶解度是优于在较高的 pH 值的溶解度。 Ca2+、 Cd2+、 Zn2+和 Cu2+植酸盐在 pH 值小于 4 到 5 可以溶解，但植酸镁在酸性 pH值到 的可以溶解。 提高能量利用率 植酸和脂肪酸钙镁聚合成脂肪 酸盐，也可以直接或间接地，结合淀粉，同时抑制α淀粉酶的活性，从而限制了淀粉的利用率，减少牲畜使用这些能量物质。 Brady 报道不同水平添加量的植酸酶在日常饮食可以提高能源利用的物质，添加 1000FTU/kg 植酸酶时提高能源利用水平 ％，另外植酸酶添加脂肪厚度。 Johnston 等向不同钙磷水平的日粮中添加植酸酶可以促进能量代谢。 以上表明，植酸酶添加的饲料和食品，可以极大地提高利用率，磷，蛋白质，矿物质，营养元素和能量。 高密度发酵 高密度发酵也称为高密度发酵技术，是一种高效表达外源蛋白表达 水平的重要战略。 该方法大大提高了发酵过程，发酵周期可缩短一半以上，菌体生产和产品表达提高10〜 50 倍，蛋白活性增加 2 至 3 倍 [9]，并能降低培养容器的体积，降低了设备投资，从而减少了生产成本，大大提高了产品在市场上的竞争力 [10]。 现在，有许多蛋白质 高密度发酵，获得高表达水平，如巴西三胶腈水解酶表达水平到 22 克 / L[11]，植酸酶表达达 g / L[12]等。 不同品系和不同菌株之间，以实现高密度水平有很大的不同，不同的外源蛋白表达水平的差异很大，造成这种差异的重要因素有两个，一个是基因工程菌自 身特点有差异的，二是发酵。 因此，想要在生物反应器中以最大限度地得到的目标蛋白，必须对发酵过程进行研究，探索产品生产的影响因素，确定最佳发酵条件。 本 科 毕 业 论 文 第 10 页 共 29 页 第 2 章 植酸酶发酵过程主要影响因素研究 目前，基因工程受到了越来越多的关注，基因工程产品从实验室到车间，实现了产业化，主要问题是如何最大限度地提高高产基因工程菌发酵。 许多因素可影响发酵产量，这些因素可以被划分为内部因素和外部因素，内部因素为工程菌的特性，包括选则基因密码子外对外源蛋白的驱动性，外源蛋白的自身特点，在毕赤酵母融合基因组外源基因。 外部因素，主要指的是 基因工程菌发酵条件，包括培养基成分的选择和种子种龄和接种量，生长和发酵过程中的 pH 值和甲醇添加量等。 种子质量：在工程菌在发酵过程中，毕赤酵母菌种的培养是一个极其重要的组成部分。 接种的菌种质量，在很大程度上决定了工程菌发酵过程中细胞的生长的速度和合成目标产品的产量。 种龄，是指种子生长年龄，就是多久才能做种。 种龄太短，用于接种种子仍然处于滞后阶段，或者刚刚进入对数生长期，会导致早期细胞生长缓慢，发酵周期延长，甚至可能导致异常发酵。 种龄太长，在稳定期后期的或衰亡阶段的种子，接种后会导致后代的延滞阶段增长，因此选 择适当的年龄接种是非常重要的。 一般选择对数生长期后期或刚进入稳定的种子细菌，这时候整体的生理特点大多一致，菌体生长快，可以很快适应新的环境，并能提高细胞干重。 接种量：接种量不同也会影响发酵率，接种较少的菌体生长缓慢，最终导致滞后期太久，发酵周期的增加，接种细胞过多，生长过于强烈，导致过多的代谢物可能会影响细胞的生长，而且对养分和氧气的需求增加，如果氧气不足，会导致对培养基的利用率下降。 选择合适的接种量，不仅缩短生长期，节约电耗，同时也提高了设备利用率。 pH 值：菌体的生长阶段或诱导表达目标蛋白的的阶段， pH 值是非常重要的影响因素。 毕赤酵母中生长 pH 值从 到 都可以，范围广泛，但在极酸性（ pH ）条件下细胞停止生长，最适生长的 pH 值范围是 〜。 谢子文对毕赤酵母发酵产植酸酶的条件进行摇瓶实验研究发现，细胞的生长阶段的最适 pH 值为 ，诱导生产阶段酶的最适 pH 值为。 温度：毕赤酵母培养温度对生长和产酶有很大的影响，培养温度过低，不利于细菌生长，从而导致较低的产酶，培养温度过高，容易导致活性物质在细胞变性，微生物的新陈代谢和循环，起到一个非常严重的负面影响。 本 科 毕 业 论 文 第 11 页 共 29 页 甲醇添加量：毕赤酵母 中含有 AXO1 独特的醇氧化酶基因启动子，在诱导期，甲醇作为酵母生长唯一碳源和的能量来源，诱导 AXO1 对外源基因表达的调控，因此，添加甲醇的量要满足酵母生长的需要，但过量甲醇会导致细胞生长抑制，因此，在实验过程中，要严格控制甲醇添加量，满足毕赤酵母对甲醇的需求，同时不影响细胞的生长。 培养时间：培养时间对细胞的生长和产酶的诱导时间有很大的影响，因此选择一个合适的发酵周期也很重要。 大多数报道的诱导时间约 160h，外源基因的表达量最高，有一些细菌甚至需要培养超过 200h。 培养时间太短，目标蛋白表达量过低，培养时间 长，外源蛋白的降解会增加，因此，选择适当的培养时间是高密度发酵的一个非常重要的方面。 试验材料 菌种 用于实验的菌种是由本实验室保存的植酸酶毕赤酵母基因工程菌。 主要试剂 甲醇 氨水 盐酸 山梨糖醇 主要仪器 主要仪器 PHS25 型 pH 计 SWCJIBV 型单人超净工作台 OL5 低速大容量离心机 TZ2H 型台式恒温振荡培养 TU1810 型紫外可见分光光度计 JJ2 型组织捣碎匀浆机 DZKWD 水浴锅 发酵罐 本 科 毕 业 论 文 第 12 页 共 29 页 试验 方法 测定方法 测定菌体浓度方法 本实验采用分光光度计比色法测定细胞浓度，将培养液稀释到一定倍数，测定波长600nm 处吸光值。 菌体摇瓶培养条件研究 本节主要研究植酸酶工程菌菌种接种量的量，菌种的不同种龄，基因工程菌生长阶段的培养基 pH 值，诱导阶段 pH，甲醇补充量，补加的时间间隔，诱导时间和诱导阶段，添加山梨糖醇 甲醇为混合碳源研究和筛选，以确定摇瓶阶段最佳的生长和诱导条件。 接种菌种量的确定 以 50 mL 麦芽汁 麦麸为培养基中分别接种 1％ ， 3％， 5％， 7％， 9％接种优质菌种，在 22 小时培养，离心机离心弃去上清，加入 25ml 消过毒的麦汁 麦麸培养基重新悬浮，甲醇的每天添加量为 ，每 24 小时在添加 ，诱导时间为 72 小时，诱导过后发酵结束取发酵生产的植酸酶的酶的活性。 种龄 将基因工程菌接种到 20ML 麦汁环 麸皮的生长培养基中。 抽样 8 个时间点（ 12h， 14h， 16h， 18h， 20h， 22h， 24h， 26h）进行细胞浓度的测定，并绘制细胞生长曲线。 分别在培养 16h， 18h， 20h， 22h， 24h， 26h 时，以 5％的接种量接种到 50 毫升麦芽 麸皮培养基，培养 22 小时，离心机离心弃去上清液，加入 25 毫升的麦汁 麸皮高温提取的培养基到离心得到的沉淀种并重新悬浮，每天甲醇的添加量 不变，每 24 小时后的额外添加 甲醇，诱导 72 小时后取样测定发酵的植酸酶活性。 在生长阶段培养基 pH 的确定 把五份 ph 调为 ,,的 50mL 的麦芽汁 麦麸生长培养基于 121℃灭菌20 分钟，备用。 接种适量的优质菌种，培养 22 小时。 然后离心机离心弃去上清，加入25 毫 升的麦芽 麸皮培养基到离心好的沉淀理并重新悬浮细胞，每天添加甲醇 ，每过 24 小时再添加一次甲醇，诱导 72 小时，结束后取培养液测定生产植酸酶活性。 成本 科 毕 业 论 文 第 13 页 共 29 页 长阶段的第一个 22 小时，每隔 4h 将 pH 值校准一次。 在诱导阶段所需的培养基 pH：将麦芽汁 麦麸生长培养基每 50 毫升分别装乳五只三角瓶，接种最适量优质的菌种培养 22 小时，离心机离心后弃去上清液，留下菌体，在三角瓶加入 25mL 的 pH 值为 , 的麦芽汁 麦麸生长培养基，重新悬浮，每天添加甲醇 ，每过 24 小时再添加一次甲 醇，诱导 72 小时，结束后取培养液测定生产植酸酶活性。 成长阶段的每 6 小时将 pH 值校准一次。 甲醇添加量和补加间隔时间 分别将 50毫升麦芽汁 麦麸生长培养基放入 250mL的烧瓶中，接种适量的优质菌种，培养 22 小时。 然后离心机离心弃去上清，装 25 毫升最适宜的 pH 值的麦芽汁 麦麸高温浸提培养基，将菌体重新悬浮。 甲醇，添加为 毫升 /天， 毫升 /天， 毫升 /天， 毫升 /天， 毫升 /天，额外每间隔为 12 小时， 24 小时添加一次。 诱导后 72 小时测定菌液浓度和测定发酵液中植酸酶活性。 使用山梨醇 甲醇混合碳源进行诱导 探讨 25％的山梨醇和甲醇的比例（ V / V）（分别为 1:2,1:4,1:6,1:8,1:10，山梨糖醇 甲醇混合碳源对产酶和诱导时间的影响。 对生产酶的影响：将麦芽汁 麦麸调好最适应的 ph 值加入到 250mL 的烧瓶中，接种适量的优质菌种，培养 22 小时，离心机离心后弃去上清，装入 25 毫升的最适应 ph 值的 麸皮培养基，细菌培养基重新悬浮，添加甲醇作为唯一碳源，诱导 72 小时后测定酶的活性。 对照组仍然是用甲醇作为唯一的碳源。 使用山梨醇 甲醇混合碳源对诱导时间 的影响： 向 50 毫升的麦汁 麦麸的生长培养基中接种适量的优质菌种，培养 22 小时后离心机离心弃去上清液，加入 25 mL 麦汁 麦麸培养基，重新悬浮于培养基，分别由甲醇单碳源和甲醇 山梨醇混合碳源诱导细菌，恒定剂量 24mL/天，分别为 12 小时， 24 小时，36 小时， 48 小时， 60 小时， 72 小时， 84 小时进行诱导，诱导完毕后取培养基样测定植酸酶活性。 本 科 毕 业 论 文 第 14 页 共 29 页 试验结果与讨论 菌体摇瓶培养条件研究 种龄 此次研究各种接种种龄，对细胞的生长和诱导产酶的影响。 在测试过程中， 12h〜26h 每 2h取细胞浓度的采样测定，根据毕赤酵母生长数据绘制的的细菌的生长曲线，如图 21 所示。 3456789101112 14 16 18 20 22 24 26培养时间（ h ）菌体浓度（OD600） 图 21 种子生长曲线。