kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜_在新种的多相分类学鉴定毕业论文(编辑修改稿)

kiyik河胡杨内生细菌多样性分析及一株潜_在新种的多相分类学鉴定毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

.............44 脂肪酸组分分析 .................................................................................46 基于 16S rRNA 基因序列的系统发育分析 ......................................47 基因组 DNADNA 杂交率 ................................................................49 基因组 G+C%含量的测定 ................................................................49 讨论 ................................................................................................................ 50 缩写表 .......................................................................................................................... 54 参考文献 ...................................................................................................................... 56 作者简介 ...................................................................................................................... 63 新疆大学硕士毕业论文 9 第一章 文献综述 1 胡杨概况 胡杨 胡杨 ( Populus euphraticu)是隶属于杨柳科杨属一种古老、原始的荒漠特有树种，远在 亿年前就已出现，被称为 “ 第三纪活化石 ”。 树高一般 1530 米，异形叶，雌雄异株，是干旱荒漠区生长的植物，从生物学特征上表现为表皮角质层较厚，叶面积相对较小，以此减少蒸腾作用带走的水分；根系发达，以获得足够的水分供应其本身的生长和蒸腾耗水 [1]。 胡杨树干内存液是胡杨对干旱高温环境条件适应性 的产 物 ，是植物应对高蒸发量的蓄水储备 ， 是胡杨树 利用它发达的根系吸收地下水，通过微管组织输送到树干、树枝及其末端的体内的蓄水 [2]。 胡杨对极端环境有很强的抗逆性，在干旱沙漠地区唯一能生存的乔木，有 “ 生而一千年不死，死而一千年不倒，倒而一千年不朽 ” 的强大生命力。 胡杨繁殖力高，生长慢、抗逆性强，对于改善生态环境，遏制沙漠化，保护生物多样性等诸多方面具有重要作用，是下游绿色走廊的一道生态屏障 [3]。 胡杨林分布状况 胡杨广泛分布于阿尔及利亚，中国，埃及，印度，伊朗，伊拉克，以色列，利比亚，巴基斯坦，阿拉 伯叙利亚共和国，土耳其，土库曼斯坦等的近 20 个欧、亚、非洲国家。 中国仍是当今世界上胡杨分布范围最广、数量最多的国家。 新疆分布着目前全世界上最大的天然胡杨林。 其面积近 3 0 万公顷，约占全国胡杨林总面积的 90％和全世界胡杨林总面积的 55％以上，是极其珍贵的自然资源 [4]。 Kiyik 河胡杨林 在塔河中游（沙雅县至尉犁县）主河道的南面，塔克拉玛干沙漠的北部边缘荒漠区，遗留着历史上由于塔河改道而干枯的 6 条较大的废弃古河道遗迹。 其中之一的 Kiyik 河流域没有人类建造的房屋，牲畜的圈棚和水井的遗迹，是未受人类 活动影响的净土；古河道沿岸，不同程度的分布着依靠地下水维系生命的衰败状胡杨林。 Kiyik 河道是塔河中游的废弃 343 年的废弃古河道， 由于 Kiyik 河和新疆大学硕士毕业论文 10 尉犁县卡尔区尕乡之间分布着直线距离 29Km以上的沙丘荒漠（没有行车的道路），断流年代比较久远，脱离了塔河水系，因此分布在 Kiyik 河流域的胡杨林形成了在时间和空间上相对隔离封闭的生态体系。 与塔河主河道相比 kiyik 河胡杨的长势较弯曲茎部分支多，表皮更粗糙，明显表达出了胡杨适应恶劣环境的形态特征。 2 植物内生菌概况 植物内生菌概念 植物内生菌 一词由希 腊语中的《 endo》（在 „ 之内）和《 phyton》（植物）组成。 内生菌概念最早是由 De Bary在 1866年 提出， 他认为 生活在植物组织内的微生物 为 内生菌 [5]，用以区分生活在植物表面的表生菌 （ Epiphyte）。 1986年Carroll[6] 将 内生菌 定义为：是 生活在活的植物组织内而对植物不引起明显病害症状的真菌，强调 了 内生菌与植物的互惠共生的关系。 在 1992年， Petrini[7]进一步扩大 了 内生菌的概念范畴，将内生菌 定义为 在其生活史中某一段时期生活在植物组织内， 并 对 寄主不 引起明显病害症状。 其后，在 1997年 Hallmann等人指出 [8]，植物内生菌是指从表面消毒的植物组织中分离而得到或从植物内部获得的，但它们的存在并未使植物的表型特征和功能有任何改变的细菌和真菌。 目前被广泛接受的定义是，能直接在植物组织内观察到或是从严格表面消毒的植物组织中分离得到，抑或是 送植物组织中直接 扩增到其核酸 DNA的，不会使宿主植物表现出至少暂时不会表现明显的 病 状的微生物 [9]。 内生菌与宿主植物的关系 地球上有约 30万种植物，它们分布的环境各也各有差异，这些多种多样的植物为微生物提供了多元化的、极为复杂多样的栖息地。 内生菌可以提高宿主植物的一些机制，包括形成的根外菌丝营养吸收，刺激根系生长，促进植物的新陈代谢，促进氮，磷的吸收，固氮，可以改善土壤或根系分泌物 [10]。 一些内生菌只将一种植物作为宿主，而另一些则有多种宿主植物。 Petrini[11]表明，某些内生菌在寄主科水平上有专一性。 也有研究中发现，寄主种的水平上有专一性的一些内新疆大学硕士毕业论文 11 生真菌。 Carroll等人 [12]发现分布在法国和瑞士的 7种针叶树不同组织中存在不同物种的内生菌，并提出了组织专一性假说。 植物内生菌代谢产物种类及其功能多样性 植物内生菌代谢产物种 类繁多，结构多样并具有各种生物学活性，主要有萜类、生物碱、皂苷类、芳香类、多肽类等 [13]。 这些代谢产物不仅能促进植物生长、固氮、抗疾病、抗害虫 和提高宿主植物抗逆境 能力，而且还有些物质有着抗肿瘤、抗 病毒和抗菌作用 [13,14]。 植物内生菌多样性研究进展 自 20世纪 30年代发现造成畜牧业重大损失的牲畜中毒是由于食用感染内生菌的牧草后，内生菌的研究才得以广泛地开展起来 [15]。 植物内生菌几乎存在于所有目前已研究过的植物中，分布广，种类多。 研究表明，感染内生菌的植物宿主往往具有生长快速、抗逆境、抗 病害、抗动物危害等优势，比未感染植株更具生存竞争力。 大量研究表明，植物内生菌的种类、分布、定植都因植物种类不同而异。 目前研究的关于微生态的植物已达上百种 [16]。 涉及藻类、针叶树、灌木和草本等多个类群，其中研究较多的植物有牧草、棉花 (Gossypium hirsutum)、小麦 (Triticum aestivum)、高粱 (Shum bicolor)、水稻 (Oryza sativa)、玉米 (Zea mays)、马铃薯 (Solanum tuberosum)、甘蔗 (Saccharum officinarum)、甜菜 (Beta vulgaris)等。 国际上已有许多从不同植物中分离可培养内生细菌的报道。 Fiona Porteous Moorea, Tanja Baracb 等人从生长在 BTEX（ Benzene, Toluene, Ethylbenzene, Xylene）污染的杨树的根，茎，叶部分取样而分离了具有不同表型的 121株内生细菌，用 16S rDNA序列鉴定， BOXPCR基因组 DNA指纹技术来确定分离菌株的进化地位，所有分离菌株隶属于 21个属，测定了分离菌株对目标污染物，重金属，抗生素的耐性，揭示了杨树 内生细菌在提高植物修复过程的潜在特性 [17]。 Rodrigo Mendes, Aline A, PizziraniKleiner 等人从甘蔗的根际，根内和茎部取样而分离了154株可培养内生细菌并鉴定 16S rDNA序列，结果发现所有的分离菌株隶属于 4个属，其中伯克霍德菌属（ Burkholderia）占优势 [18]。 Pious Thomas .Ganiga K. Swarna等人通过 16S rDNA序列鉴定分离于香蕉茎尖培养物的可培养和免培养内新疆大学硕士毕业论文 12 生细菌，这些细菌隶属于 5个门和 20个不同的属 [19]。 Anastasia Venieraki , Maria Dimou等人从希腊不同地区的小麦根际中分离了 17株可培养固氮菌，隶属于 3个属，并且研究促进植物生长的菌株的特性 [20]。 在国内河北大学生科院的 Jigang Han等人把毛竹根际，根表面和根内组织作为样品使用 2种培养基分离了 182株菌株，鉴定了属于 22个属的 56个不同的分类单元的 16S rDNA序列 [21]。 首都师范大学生科院的 Lei Sun, Fubin Qiu等人把河北省农业试验站的水稻作为样品分离了可培养内生细菌，克隆 192株菌株的 16S rDNA基因，并 鉴定了 52个分类单元的基因序列 [22]。 近年来，从植物内生细菌中分离新的次生代谢活性物质和利用内生菌对植物病原菌进行生物防治成为了国内外研究的热点。 截至到 20xx年在各种植物中发现的可培养植物内生细菌已超过 129种，分别属于 54个属 [23] ,其中分离到的新种也相当可观。 植物内生菌多 样性研究方法 [24] 以生化技术为基础的研究方法 1) 平板计数和形态分析 通过人工配制的简单营养基质对土壤中的微生物进行定时定温培养，然后对生长的菌落进行计数、并通过形态构造和生理生化特性来鉴定种属。 该方法直 观快捷，而且可以提供具有代谢活性、异养类型等种群信息。 然而，微生物在实际土壤生境中的生长与温度、 pH 值、养分和种间的相互作用有很大关系，简单的人工模拟环境是无法满足其生长要求的。 因此，这种方法仅能培养出极少数 ( 少于 1% ) 的微生物。 2) 群落水平生理学指纹 ( CLPP) 或单一碳源利用模式法 ( SSCU) 是基于某一微生物群落所含有的酶可催化利用特定的碳源基质，然后通过测定其利用能力和模式来评价微生物种群多样性。 Garlan 和 Mills[25]于 1991 年首次提出该技术，经 BIOLOG 公司商业化后在土壤 微生物群落功能多样性的评价研究中得到了广泛的应用 [26]。 BIOLOG 公司根据不同的检测目的开发了 ECO( 生态板 ) 、 GP( 革兰氏阳性板 ) 、 GN( 革兰氏阴性板 ) 、 FF( 丝状真菌板 ) 和 MT 等一系列微平板。 每个平板上有 96 个微井，其中 95 个微井的干膜上都含有碳新疆大学硕士毕业论文 13 源基质和氧化还原染料，一个不含碳源的微井用作对照。 当微生物利用碳源进行呼吸时释放出的 NADH 还原染料并使其变色，然后通过测定氧化还原燃料的变色速率来推测微生物的呼吸速率，最终达到评价能利用碳源基质的微生物种类和利用程度的目 的。 3) 生物标记法 生物标记法主要是利用微生物细胞内某种生化成分的结构特点来区别微生物种类。 这种方法避免了传统培养法的缺陷，能比较客观地评价微生物多样性。 方法的主要步骤是通过提取土壤微生物中的某种生化成分并纯化，然后利用气、液相色谱等化学手段对该种化学成分进行分类鉴定。 常用的微生物多样性生物标记法有 : 磷脂脂肪酸分析法 和呼吸醌指纹法。 现代分子生物学技术 1) 荧光原位杂交技术 ( FISH) 利用探针可以直接和环境土壤样品、纯培养菌落进行原位杂交，获得自然和人工状态下微生物种类、相对丰度和空间分布信息。 2) 土壤宏基因组学 Handelsman等 [27]于 1998 年首次提出宏基因组学的概念，即不需要经过培养、分离单一种类的微生物，而 是利用现代基因组技术直接研究自然状态中环境微生物群落。 土壤宏基因组学的主要任务之一就是揭示土壤微生物群落多样性。 通过16S rRNA 基因文库的构建和系统化分析来研 究土壤微生物群落种类和存在丰度，并且挖掘有用的基因，使土壤微生物多样性分析更趋于完整客观。 该方法的步骤主要包括土壤 DNA 的提取克隆文库的构建和筛选。 3) 基因指纹图谱技术 基因指纹图谱技术是基于基因在长度、成分和结构上的 多态性，利用电泳方法将复杂的 PCR 扩增片断分 离成简单的基因条带图谱，然后根据条带信息进行基因分析的技术。 包括限制性片断长度多态 (restriction fragment length polymorphism， RFLP)、核糖体间隔区分析 ( ribosomal intergenic spacer analysis，RISA)、 随机扩增多态性 DNA( random amplified polymorphic DNA， RAPD)变性新疆大学硕士毕业论文。