卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计(编辑修改稿)

卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计(编辑修改稿)内容摘要：

1~2 层。 C 级：裸卵或卵丘细胞虽为 1~2 层或多层，但是不完整，部分裸露。 A 级卵母细胞的培养效果要优于 B 级和 C 级。 目前，常用的采集猪卵母细胞的方法有三种即抽吸法、切割法和刺破法，相对于刺破法和切割法而言，抽吸法较为常用，但是所获得的卵母细胞质量较差，甚至出现较多的裸卵，进而间接地影响了体外培养的效果。 卵母细胞体外成熟的物理性因素 体外成熟培养条件 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 4 温度 不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养温度因动物种类的不同而不同，猪所需要的温度一般为 38℃ ~39℃较为适宜，过高或过低都不利于细胞的发育。 湿度 在 IVM 时一般采用的是饱和湿度，目的是减少培养基内的水分蒸发，从而维持培养基中卵母细胞所需要的各种物质的浓度及保持渗透压。 通常在培养基上面覆盖一层石蜡油或矿物油，以使在培养箱内或离箱操作时维持培养基的气相、湿度与 pH 值。 此外，培养箱所用的水的纯度和高度无菌也是培养成功的关键性因素。 气相环境 目前卵母细胞常用的培养气相有两种即是 5%CO 5%O90%N2和 5%CO 95%的空气 [xxxii]。 在这两种气相中， CO2 的含量很关键。 多数培养基在配制前都已将 pH 值调好，并具有一定的缓冲能力，因此， 5%CO2 则刚好是维持 pH 所必需。 另外，要保证所用气体的无毒。 不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养时间因动物种类的不同而有所不同，大多数哺乳动物所需要的体外培养时间为 22~24h，但是对猪而言，却需要更长的时间，一般，猪卵母细胞体外成熟培养的时间为 44h。 Sosnowki 等研究发现培养 40~48 h 与 30~36 h 对猪卵母细胞体外成熟率差异显著，但是分析染色体核型发现，随着体外培养时间的延长，染色体异常率会随之增加。 目前，常用的猪卵母细胞体外成熟培养方式有微滴培养法、套皿培养法及普通的单皿培养法。 相对于普通的单皿培养法而言，微滴培养法和套皿培养法可以更好的保持细胞发育所需要的微环境，同时减少微生物的污染。 李俊等研究认为在猪卵母细胞体外成熟培养中，套皿培养法可以代替微滴培养法中矿物油的作用，从而可以减少矿物油对细胞的危害。 成熟基础液的构成 ,直接影响到卵母细胞的成熟率及以后的受精和胚胎发育。 猪卵母细胞的 IVM 液有 Whitten39。 s medium， NCSU23， TCM199NCSU37。 目前猪卵母细胞体外培养的基础培养液以 TCM199和 NCSU23使用较多。 成熟燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 5 培养的基础培养液不同卵母细胞成熟后 GSH 的含量存在显著差异， IVF后雄原核形成率也不同。 Wang等人的研究显示在 NCSU23 中成熟的卵母细胞 IVF 后囊胚发育率显著高于在 TCM199 和改良 Whitten39。 s 液中 Lalantha等人认为在不添加蛋白质添加物的情况下 TCM199 更有利于卵母细胞的核成熟，而在Waymouth基础液中成熟的卵母细胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚发育率较低。 王海等研究发现，卵母细胞在两种培养液中的成熟率差异不显著。 但叶华虎等研究发现，受精后胚胎发育能力 NCSU23占明显优势。 在卵母细胞的体外培养体系中， FSH、 LH 有利于改变卵丘细胞的代谢机能，并阻断卵丘细胞通过胞间连接向卵母细胞分泌减数分裂抑制因子的途径，从而使卵母细胞恢复成熟分裂过程。 在猪卵 母细胞体外成熟研究中，许多学者都选择添加 PMSG,有人还认为添加 PMSG 和 hCG 的组合对猪卵母细胞核成熟的促进作用优于添加 FSH 和 LH。 尤其对于 LH 的添加存在争议，有研究者认为 LH 在卵母细胞培育过程中并未发挥作用， Izadyar 等认为在不含血清的成熟培养液中，只有 FSH 能影响卵母细胞的成熟，而 LH 没有作用；Bevers 等认为小于 8mm 的牛卵泡中，颗粒细胞上只有 FSH 受体 mRNA，而没有 LH 受体 mRNA。 但彭礼繁等却认为 LH 对猪卵母细胞体外成熟的促进效果要强于 FSH。 在早期的研究中 ，促性腺激素多数存在于整个体外培养过程，但 1994 年，Funashi 等的研究表明，在猪卵母细胞 IVM 时，培养前 20 h 加入 PMSG、 hCG、E2，而在培养后 20 h 去除，可增加卵母细胞的成熟率，同时可以促进卵母细胞减数分裂和胞质的成熟，而且有利于卵母细胞的发育和受精。 蔡令波等在培养后期去除促性腺激素也得出了相似结果。 自 20 世纪 80 年代血清应用于卵母细胞的体外成熟培养以来，血清在卵母细胞体外成熟培养的作用逐渐被发现并利用，血清中含有许多成分包括能量物质、氨基酸、维生素、激素、生长因子和细胞因子等等能够促进原始卵泡卵母细胞生长启动，并提供生长所需的一种或几种因子，因而，培养液中添加动物血清可促进卵母细胞成熟。 在猪卵母细胞体外培养中，用得最广泛的是在成燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 6 熟培养液中添加 10%的胎牛血清（ Fetal bovine serum， FBS）。 蔡令波等曾研究表明发情牛血清（ Estrus cows serum， ECS）较新生犊牛血清（ Newborn Calf Serum， NCS）更有利于猪卵母细胞体外成熟。 近年来，许多研究者又在猪的卵母细胞成熟培养液中添加一定比例的猪血清，其中包括 :新生仔猪血清，母猪发情的血清等。 虽然血清对于猪卵母细胞的体外培养有较好的促进作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、维生素、细胞因子、生长因子，以及许多未知物质，并且容易被支原体感染。 此外血清的来源不同、批次不同均会导致血清中所含组分及组分间比例不同，从而导致了卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养的不稳定。 因此，寻找比较适宜的血清替代品成为当前的一大研究 热点，目前用来代替血清的替代品有牛血清白蛋白 (Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇 (Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮 (polyvinylpyrrolidone， PVP)等大分子有机物质。 猪卵泡液 (pig follicular fluid， pFF)是猪卵母细胞发育的微环境，对卵母细胞的成熟有着重要的调节作用，主要表现在提高猪卵母细胞成熟的质量并增加胚胎的发育能力。 Naito 等 [xlv]的研究认为：在体外成熟培养中， PFF 可以 促进猪卵母细胞胞质的成熟，并显著提高猪卵母细胞受精后的原核形成率。 Yashida 等报道在成熟培养基中添加猪卵泡液可显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。 Vatzias 等研究发现冷冻卵泡液在促进卵母细胞的成熟、降低多精受精方面优于新鲜卵泡液，孟庆刚等认为在激素存在的条件下， pFF 具有促进猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的作用。 与卵母细胞体外成熟相关的细胞生长因子主要包括表皮生长因子(Epidermal growth factor， EGF)，胰岛素样生长因子 (insulinlike growth factors，IGF)、成纤维细胞生长因子 (Fibroblast Growth Factor， FGF)、转化生长因子(transforming growth factor， TGF )及神经生长因子 (nerve growth factor， NGF)等，这些细胞生长因子之间相互作用，对卵母细胞的成熟、受精与卵裂起着重要作用。 燕 山 大 学 课 程 设 计 说 明 书 7 目前已经证实， EGF 可以促进猪卵母细胞的核成熟。 Abeydeera 的研究表明， EGF 能提高卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，从而提高卵母细胞胞质的质量， IGF 对细胞具有促分裂、分化及促代谢等生物学功能，是一个具有多种生理功能的生长因子，因此，同样能促进猪卵母细胞的成熟，并能提高所得胚胎的发育能力。 TGFα，在结构上和功能上与 EGF 相似，因而也可以与EGF受体结合，诱导猪卵丘细胞的扩散，促进卵母细胞核成熟。 NGF 也是猪卵母细胞体外成熟过程中重要的调节物质之一，能影响猪卵母细胞成熟的动力学，加快进入 M11 期。 卵母细胞的体外成熟可以为细胞核移植、转基因等胚胎工程的研究提供大量卵母细胞。 在排卵前，由于促性腺激素的作用， 卵母细胞完成减数分裂的同时，卵丘卵母细胞复合物（ 4C4D）的卵丘发生扩展， 4C4D在体外成熟培养过程中也发生类似的变化。 卵丘细胞与卵母细胞、卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系很复杂。 本文主要对卵丘细胞在卵母细胞体外成熟培养过程中的作用加以阐述，进而对卵母细胞的体外成熟培养加以改进。 卵丘细胞与卵母细胞在卵母细胞成熟过程中的结构与功能联系 卵母细胞的发育成熟与其周围的卵泡细胞的作用是分不开的。 原始卵泡由位于中心的卵母细胞和其周围的一层扁平卵泡细胞组成。 此时卵母细胞处于第一次减数分裂前期，以后随着卵母细胞 开始生长，卵泡细胞迅速增殖，由单层变为多层。 在这些卵泡细胞内，线粒体和粗面内质网丰富。 卵泡细胞和卵母细胞伸出突起。