高效液相色谱知识收藏doc75-经营管理(编辑修改稿)

高效液相色谱知识收藏doc75-经营管理(编辑修改稿)内容摘要：

管连接，中间也放置压环用于柱接头的密封。 为了尽量减少柱外死体积，在安装色谱柱时，用Φ 连接管通过空心螺钉压环后要尽量插到底，然后再拧紧空心螺钉。 压环被空心螺钉挤压变形后紧箍在连接管上 (连接管通过压环后露出的管长度应严格控制在 2． 5mm 长或其它固定尺寸 )。 在两端柱接头内，柱管两端各放置一片不锈钢滤片 (或滤网 )，用于封堵柱填料不被流动相冲出柱外而流失。 空柱各组件均为 316不锈钢材质，能耐受一般的溶剂作用。 但由于含氯化物的溶剂对其有一定的腐蚀性，故使用时要注意，柱及连接管内不能长时间存留此类溶剂，以避免腐蚀。 b、柱填料： 液相色谱柱的分离作用是在填料与流动相之间进行的，柱子的分类是依据填料类型而定。 正相柱：多以硅胶为柱填料。 根据外型可分为无定型和球型两种， 其颗粒直径在 3— 10 μ m的范围内。 另一类正相填料是硅胶表面键合 — CN， NH2 等官能团即所谓的键合相硅胶。 反相柱：主要是以硅胶为基质，在其表面键合十八烷基官能团 (ODS)的非极性填料。 也有无定型和球型之分。 常用的其它的反相填料还有键合 C C C苯基等，其颗粒粒径在 3—10 μ m 之间。 2，色谱柱的安装： a、拆开柱包装盒，确认色谱柱的类型、尺寸、出厂日期以及柱内贮存的溶剂。 b、拧下柱两端接头的密封堵头放回包装盒供备用。 c、 按柱管上标示的流动相流向，将色 谱柱的入口端通过连接管与进样阀出口相连接 (如条件允许，建议在柱前使用保护柱 )；柱的出口与检测器连接。 连接管是外径为 、内径为 的不锈钢管。 连接管的两端均有空心螺钉及密封用压环。 在接管时一定要设法降低柱外死体积。 连接管通过空心螺钉、压环后尽量用力插到底，然后顺时针拧紧空心螺钉，直到拧不动为止，再用扳手继续顺时针拧 1／ 41／ 2 圈，切记不要用力过大。 如色谱柱通过流动相加压后有漏液现象，请用扳手继续顺时针拧 1／ 4圈，直至不漏液为止。 二、液相色谱柱的使用： 色谱柱在使用前，最好进行 柱的性能测试，并将结果保存起来，作为今后评价柱性能变化的参考。 但要注意：柱性能可能由于所使用的样品、流动相、柱温等条件的差异而有所不同；另外，在做柱性能测试时是按照色谱柱出厂报告中的条件进行 (出厂测试所使用的条件是最佳条件 )，只有这样，测得的结果才有可比性。 样品的前处理： a、最好使用流动相溶解样品。 b、使用予处理柱除去样品中的强极性或与柱填料产生不可逆吸附的杂质。 c、使用 m 的过滤膜过滤除去微粒杂质。 流动相的配制： 液相色谱是样品组分在柱填料与流 动相之间质量交换而达到分离的目的，因此要求流动相具备以下的特点： 中国最大的管理资料下载 中心 (收集 \整理 . 部分版权归原作者所有 ) 第 12 页 共 70 页 a、流动相对样品具有一定的溶解能力，保证样品组分不会沉淀在柱中 (或长时间保留在柱中 )。 b、流动相具有一定惰性，与样品不产生化学反应 (特殊情况除外 )。 c、流动相的黏度要尽量小，以便在使用较长的分析柱时能得到好的分离效果；同时降低柱压降，延长液体泵的使用寿命 (可运用提高温度的方法降低流动相的黏度 )。 d、流动相的物化性质要与使用的检测器相适应。 如使用 UV检测器，最好使用对紫外吸收较低的溶剂配制。 e、流动相沸点不 要太低，否则容易产生气泡，导致实验无法进行。 f、在流动相配制好后，一定要进行脱气。 除去溶解在流动相中的微量气体既有利于检测，还可以防止流动相中的微量氧与样品发生作用。 流动相流速的选择： 因柱效是柱中流动相线性流速的函数，使用不同的流速可得到不同的柱效。 对于一根特定的色谱柱，要追求最佳柱效，最好使用最佳流速。 对内径为 的色谱柱，流速一般选择 1ml／ min，对于内径为 柱，流速 ／ min 为佳。 当选用最佳流速时，分析时间可能延长。 可采用改变流动相的洗涤强度 的方法以缩短分析时间 (如使用反相柱时，可适当增加甲醇或乙腈的含量 )。 注意： a．由于甲醇廉价，对于反相柱推荐使用甲醇体系 (必须使用乙腈的场合除外 )。 b．对于正相柱推荐使用沸程为 3060℃的石油醚或提纯后的己烷作流动相，没有提纯的己烷不得使用。 用水最好使用超纯水 (电阻率大于 18 兆欧 )，去离子水及双蒸水中含有酚类杂质，有可能影响分析结果。 c．含水流动相最奸在实验前配制，尤其是夏天使用缓冲溶液作为流动相不要过夜。 最好加入迭氮化钠，防止细菌生长。 d．流动相要求使用 μ m 滤膜过滤，除去微粒杂质。 e．使用 HPLC 级溶剂配制流动相，使用合适的流动相可延长色谱柱的使用寿命，提高柱性能。 柱性能测试： 启动液相色谱仪： a、流动相流速设定为 1ml／ min。 b、 UV 检测器波长设定为 254nm。 使用出厂测试时使用的流动相组成及测试样品。 记录并计算测试结果。 *参考 (标准 JB522691)液相色谱仪测试用标准色谱柱。 中国最大的管理资料下载 中心 (收集 \整理 . 部分版权归原作者所有 ) 第 13 页 共 70 页 高压液相色谱 HPLC培训教程 (一 ) I．概论 一、液相色谱理论发展简况 色谱法的分离原理是：溶于流动相 (mobile phase)中的各组分经过固定相时，由于与固定相 (stationary phase)发生作用（吸附、分配、离子吸引、排阻、亲和）的大小、强弱不同，在固定相中滞留时间不同，从而先后从固定相中流出。 又称为色层法、层析法。 色谱法最早是由俄国植物学家茨维特（ Tswett）在 1906 年研究用碳 酸钙分离植物色素时发现的，色谱法 (Chromatography)因之得名。 后来在此基础上发展出纸色谱法、薄层色谱法、气相色谱法、液相色谱法。 液相色谱法开始阶段是用大直径的玻璃管柱在室温和常压下用液位差输送流动相，称为经典液相色谱法，此方法柱效低、时间长（常有几个小时）。 高效液相色谱法 (High performance Liquid Chromatography， HPLC)是在经典液相色谱法的基础上，于 60 年代后期引入了气相色谱理论而迅速发展起来的。 它与经典液相色谱法的区别是填料颗粒小而均匀，小颗粒 具有高柱效，但会引起高阻力，需用高压输送流动相，故又称高压液相色谱法 (High Pressure Liquid Chromatography， HPLC)。 又因分析速度快而称为高速液相色谱法 (High Speed Liquid Chromatography， HSLP)。 也称现代液相色谱。 二、 HPLC 的特点和优点 HPLC 有以下特点： 高压 压力可达 150~300Kg/cm2。 色谱柱每米降压为 75 Kg/cm2 以上。 高速 流速为 ~ ml/min。 高效 可达 5000 塔板每米。 在一根柱中同时分离 成份可达 100 种。 高灵敏度 紫外检测器灵敏度可达。 同时消耗样品少。 HPLC 与经典液相色谱相比有以下优点： 速度快 通常分析一个样品在 15~30 min，有些样品甚至在 5 min 内即可完成。 分辨率高 可选择固定相和流动相以达到最佳分离效果。 灵敏度高 紫外检测器可达 ，荧光和电化学检测器可达。 柱子可反复使用 用一根色谱柱可分离不同的化合物。 样品量少，容易回收 样品经过色谱柱后不被破坏，可以收集单一组分或做制备。 中国最大的管理资料下载 中心 (收集 \整理 . 部分版权归原作者所有 ) 第 14 页 共 70 页 三、色谱法分类 按两相的物理状态可分为：气相色谱 法 (GC)和液相色谱法 (LC)。 气相色谱法适用于分离挥发性化合物。 GC 根据固定相不同又可分为气固色谱法 (GSC)和气液色谱法 (GLC)，其中以 GLC 应用最广。 液相色谱法适用于分离低挥发性或非挥发性、热稳定性差的物质。 LC 同样可分为液固色谱法 (LSC)和液液色谱法(LLC)。 此外还有超临界流体色谱法 (SFC)，它以超临界流体（界于气体和液体之间的一种物相）为流动相（常用 CO2），因其扩散系数大，能很快达到平衡，故分析时间短，特别适用于手性化合物的拆分。 按原理分为吸附色谱法 (AC)、分配色谱法 (DC)、离子交换色谱法 (IEC)、排阻色谱法 (EC，又称分子筛、凝胶过滤 (GFC)、凝胶渗透色谱法 (GPC）和亲和色谱法 ,此外还有电泳。 按操作形式可分为纸色谱法 (PC)、薄层色谱法 (TLC)、柱色谱法。 四、色谱分离原理 高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分 子排阻色谱法。 1．液固色谱法 使用固体吸附剂，被分离组分在色谱柱上分离原理是根据固定相对组分吸附力大小不同而分离。 分离过程是一个吸附－解吸附的平衡过程。 常用的吸附剂为硅胶或氧化铝，粒度 5~10μ m。 适用于分离分子量 200~1000 的组分，大多数用于非离子型化合物，离子型化合物易产生拖尾。 常用于分离同分异构体。 2．液液色谱法 使用将特定的液态物质涂于担体表面，或化学键合于担体表面而形成的固定相，分离原理是根据被分离的组分在流动相和固定相中溶解度不同而分离。 分离过程是一个分配平衡过程。 涂布式固定相应具有良好的惰性；流动相必须预先用固定相饱和，以减少固定相从担体表面流失；温度的变化和不同批号流动相的区别常引起柱子的变化；另外在流动相中存在的固定相也使样品的分离和收集复杂化。 由于涂布式固定相很难避免固定液流失，现在已很少采用。 现在多采用的是化学键合固定相，如 C1 C氨基柱、氰基柱和苯基柱。 中国最大的管理资料下载 中心 (收集 \整理 . 部分版权归原作者所有 ) 第 15 页 共 70 页 液液色谱法按固定相和流动相的极性不同可分为正相色谱法 (NPC)和反相色谱法 (RPC)。 正相色谱法 采用极性固定相 (如聚乙二醇、氨基与腈基键合相 )；流动相为相对非极性的疏水性溶剂 (烷烃类如正已烷、环已烷），常加入乙醇、异丙醇、四氢呋喃、三氯甲烷等以调节组分的保留时间。 常用于分离中等极性和极性较强的化合物(如酚类、胺类、羰基类及氨基酸类等）。 反相色谱法 一般用非极性固定相（如 C1 C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。 适用于分离非极性和极性较弱的化合物。 RPC 在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个 HPLC 应用的 80%左右。 随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐 渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的 pH 值。 但需要注意的是， C18 和 C8使用的 pH 值通常为 ~（ 2~8），太高的 pH 值会使硅胶溶解，太低的 pH 值会使键合的烷基脱落。 有报告新商品柱可在 pH ~10 范围操作。 正相色谱法与反相色谱法比较表 正相色谱法 反相色谱法 固定相极性 高～中 中～低 流动相极性 低～中 中～高 组分洗脱次序 极性小先洗出 极性大先洗出 从上表可看出，当极性为中等时正相色谱法与反相色谱法没有明显的界线（如氨基键合固定相）。 3．离子交换色谱法 固定相是离子交换树脂，常用苯乙烯与二乙烯交联形成的聚合物骨架，在表面未端芳环上接上羧基、磺酸基（称阳离子交换树脂）或季氨基（阴离子交换树 脂）。 被分离组分在色谱柱上分离原理是树脂上可电离离子与流动相中具有相同电荷的离子及被测组分的离子进行可逆交换，根据各离子与离子交换基团具有不同的电荷吸引力而分离。 缓冲液常用作离子交换色谱的流动相。 被分离组分在离子交换柱中的保留时间除跟组分离子与树脂上的离子交换基团作用强弱有关外，它还受流动相的pH值和离子强度影响。 pH 值可改变化合物的解离程度，进而影响其与固定相的作用。 流动相的盐浓度大，则离子强度高，不利于样品的解离，导致样品较快流出。 离子交换色谱法主要用于分析有机酸、氨基酸、多肽及核酸。 4． 离子对色谱法 又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。 它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。 主要用于分析离子强度大的酸碱物质。 中国最大的管理资料下载 中心 (收集 \整理。