免疫组化基本技术(ppt102)-工艺技术(编辑修改稿)

免疫组化基本技术(ppt102)-工艺技术(编辑修改稿)内容摘要：

水冲洗，系列乙醇浸泡，凉干涂胶，如需开展原位杂交，还需将玻片 240℃ 烤 2h。 (2)切片粘合剂的种类 多聚赖氨酸（分子量 300KD）： %浓度。 APES试剂（ 3氨基、丙基三氧基硅烷）：干净载玻片 → 丙酮 5min →APES （ 1ml+50ml丙酮）：用镊子夹住浸入 APES试剂 1～ 3次 → 纯丙酮洗二次→ 干燥玻片 → 用铝箔包好，室温或 4℃ 保存备用。 铬矾明胶液： 铬矾 明胶 5g H2O2 1000ml 甲醛明胶液： 40％甲醛 明胶 H2O2 100ml ： ： IHC冰冻切片， ISH冰冻切片 (恒冷箱冰冻切片机和开放式冰冻切片机 ) ： (1)连续切片按序贴在玻片的下 1/3。 (2)52－ 60℃ 烤片 18h。 (3)切片厚 2～ 4μ m。 (4)切片刀要快 (5)编上号 (6)切片可在 4℃ 保存数年（石蜡切片） (7)冰冻切片后需凉干后立即固定 (8)冰冻切片分固定和新鲜组织，固定组 织需经庶糖处理 24h，冰冻切片。 (9)冰冻切片固定后 80℃ 保存备用 八、组织与细胞材料的保存 ： 80℃ ， 145℃ ， 198℃ 组织应在离体 30min内，快速取材，放入专用冷冻管中，并编上号，登记在册。 ，装入冻存管 中， 80℃ 冻存。 可根据需要将细胞直接培养在盖玻片上， 9孔板上的细胞可经固定后 80℃ 保存备用，大容量培养的细胞收集冻存在液氮中。 第二部分 IHC的一些基本技术 主要内容 一、实验的设计 二、石蜡切片的脱蜡至水 三、内源性酶的消除方法 四、 IHC的非特异性染色 五、抗原的暴露和修复 六、抗体的购置及注意事项 七、抗体最佳稀释度的测定和保存 八、显示系统及衬染剂的选择和配制 九、 IHC常用缓冲液 一、实验的设计 ，列出要做的IHC指标，根据经费情况，选择相关公司购置特异性抗体和检测试剂。 IHC实验操作流程，选择何种 IHC前 处理方式。 ， 应设置何种对照。 ，孵育 时间和温度，同一的显色时间。 二、石蜡切片脱蜡至水 冰冻切片从 80℃ 取出，凉干或电吹风吹干后可直接进行免疫组化标记。 石蜡切片需经如下脱蜡才能做 IHC。 二甲苯 Ⅰ10min ，二甲苯 Ⅱ10min ，二甲苯 10minⅢ ，无水乙醇 2min， 95％乙醇 2min， 85％乙醇 2min， 75％乙醇2min，流水冲洗。 三、内源性酶的消除方法 (一 )内源性过氧化物酶的消除方法： 1. %～ 3%H2O2甲醇液 20min 2. 1％ H2O2 20min 3. 3％苯肼溶液 37℃ 1h 4. %盐酸甲醇液 30min NaN3 硼酸钠： %过碘酸 10min， 经洗后 1％硼酸钠处理 10min。 ～60min。 (二 )内源性碱性磷酸酶的消除方法 1. 10％醋酸 10min 2. （ ） 20min 3. 1mol/L左旋咪唑 20min (三 )内源性生物素的消除方法 2甲基 D苷露糖饱和生物素 25μ g/ml卵白素孵育 15min， PBS洗 10min，移至生物素饱和液中处理 15min，PBS洗 15min。 四、 IHC的非特异性染色 组织所带电荷差异很大，可引起非特异染色。 解决方法： Fab切除 五、酶消化和抗原修复。 (1)固定液的影响 自 1893年 Ferdinand Blum创立组织固定以来，为了避免组织固定液对抗原决定簇的影响，已经寻找到几十种固定液，目的就是为了对一定抗原起到保护作用，同时还能获得良好的组织形态结构。 目前无一种固定液适用于所有的抗原，从组织细微结构的保存，稳定。