分子生物学实验基础知识(doc15)-经营管理(编辑修改稿)

分子生物学实验基础知识(doc15)-经营管理(编辑修改稿)内容摘要：

胞（大肠埃希菌），使目的基因随载体在细胞内复制、扩增。 实验步骤介绍如下： 图 183 基因重组方案之一 ⒈大肠埃希菌的处理（增加细胞膜通透性，便于基因进入细胞）大肠埃希菌（ cells）接种于 Lb agar 培养基， 37℃ 培养一晚。 挑选 3~5 个大菌落，接种于 50ml LB 培养基， 37℃ ，振摇培养一晚后，在 A550测定，要求细菌繁殖一定量（一般为细菌对数生长期），野生型（ rec＋， 5x107cells/ml）为 ，缺陷型（ rec， 5x107cells/ml）为。 离心弃去上清液，用 20ml， 50mmol/L， CaCl2悬浮菌体。 冰浴 20 分钟，低温离心。 弃上清液，用 50mmol/l CaCl2悬浮。 4℃ 可保存 48 小时，用于转化，称 petent cells。 ⒉质粒（如经基因重组建立的重组质粒，基因库等）的转化 将 competent cells（以美国 BRL 公司 DH10B 菌株为例）置冰水浴。 同时将 Falcon2059（传热系数稳定）塑料试管置冰水浴。 取 100μl 菌液（ DH10B）于 2059 试管中，加 10 倍稀释 的巯基乙醇 1μl，冰浴轻摇 2 分钟，放置 10 分钟。 取 质粒加入试管，轻轻摇匀，冰浴 30 分钟。 此间备好 42℃ 水浴。 并将 SOC 培养基置 42℃ 备用。 将试管置于 42℃ ，轻摇 45 秒钟，马上置冰浴 2 分钟。 使 petent cells 热胀冷缩，把质粒导入菌体。 加 42℃ SOC 培养基 于试管， 37℃ 培养 1 小时。 1000rpm 离心 10 分钟，弃上清液，用 200μlSOC 培养基悬浮菌体。 接种于 LB氨芐青霉素（ 100U/ml）培养皿，37℃ 培养一晚。 已转化的菌体可形成菌落（因质粒上有抗氨芐青霉素基因）。 在了 解目的基因或其产物的基础上对菌落进行鉴定。 并在 LB 培养液中扩大培养。 基因库的建立、转化、筛选、扩增、纯化的过程就是基因克隆的过程。 LB 培养基（ 1L）： 10g蛋白胨， 5g 酵母膏， 10g NaCl，高压灭菌，。 SOB 培养基（ 1L）： 20g蛋白胨， 5g 酵母膏， NaCl，高压灭菌。 另外准备 2mol/L 镁溶液（ 1mol/L 氯化镁与 1mol/L 硫酸镁等量混匀，过滤灭菌），临用前加 1ml于 100ml 培养基。 SOC 培养基（ 100ml）：临用前加入 1ml 过滤灭菌的 2mol/L 葡萄糖。 四、核酸的分离与纯化 核酸存在于多种细胞，如病毒、细菌、寄生虫、动植物细胞；多种标本中，如血液、组织、唾液、尿液等其它来源的标本。 因此分离方法复杂而多样。 又因各种 DNA、 RNA 的丰度差异，各种分析方法对核酸的纯度与量的要求有差异，因此在实验前应对采用的方法有所了解和选择。 总的说来核酸的分离与纯化是在溶解细胞的基础上，利用苯酚等有机溶剂抽提（核酸溶于缓冲液，即水相），分离，纯化；乙醇、丙酮等有机溶剂沉淀，收获。 溶解细胞的方法因标本不同而不同，有用 SDS 加 NaOH，有用蛋白酶，有的用超声波破碎等方法，苯酚 提取主要使蛋白质变性沉淀于有机相，而核酸保留在水相，达到分离核酸的目的。 实验上生物标本中含量最多的就是蛋白质。 为了除去分离过程中残留的有机溶剂，常用的方法是加冷乙醇和盐沉淀核酸，通过离心回收核酸，然后用 70％ 80％乙醇洗涤沉淀，除去多余的盐，以免影响核酸溶解和抑制后续步骤的酶促反应。 为了得到纯的核酸可用蛋白酶除去蛋白，用 RNA 酶除去 RNA，得到纯的 DNA，用 DNA 酶除去 DNA 而获得 RNA。 目前开发了许多商品化的核酸分离柱，可简单、快速地分离得到纯度很高的 DNA 或 RNA。 其分离原理有的利用核酸的分子量差异， 有的利用需分离核酸的特点与其特异性结合达到分离、回收的目的。 （一）质粒的分离与纯化 含质粒的 E. Coli cells 经 LB。