禽流感实验室检测技术方案(doc35)-工艺技术(编辑修改稿)

禽流感实验室检测技术方案(doc35)-工艺技术(编辑修改稿)内容摘要：

胞形成一个小团，但边缘不光滑，四周有小凝块者为 +。 红细胞于孔底形成一个小团，边缘光滑并有立体感，将板倾斜片刻，就可见红细胞滑动象人的眼泪滴样者为 —。 但用豚鼠或人“ O”型红细胞时常见不到孔底形成一个小团和眼泪滴 样结果出现。 “ 177。 ”即为可疑，计算时以“ — ”（阴性）处理。 C4． 3 红细胞凝集滴度计算 结果以 ++为终点，亦即一个凝集单位。 也就是说最高稀释度病毒能引起 ++号的红细胞凝集为终点，此稀释度的倒数为红细胞凝集滴度，简称血凝滴度。 下面以表 1 为例，进行计算。 表１ 红细胞凝集单位计算 标本号 病毒稀释度 滴度 备注 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ — — 480 取均数 2 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ + — 560 小 1/8 3 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++ — 640 不必算 4 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ — 800 大 1/4 5 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ +++ +++ — 640 先整后算 6 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 1280 或 ≥ 1920 7 — — — — — — — — 10或≤ 口诀： 1． 先整后算。 表 1 中， 14， 6 和 7 不必进行整理，而 5 中，必须将 1： 640 处一个加号挪到 1： 320 处为 4 个加号，而 1： 160 处变成两个加号，然后再进行计算。 2． 两个加号不用算。 如表 1 中的 3，滴度为 640。 3． 小，小本身的 1/8。 如表 1 中的 2， 1： 640 处仅一个加号，故血凝滴度一定小于 640，应为 640640/8=560。 4． 大，大本身的 1/4。 同理 4 中血凝滴度一定大于 640，应为 640+640/4=800。 5． 两个极端取中间。 如 1， 1： 320 为 4 个加号， 1： 640 为阴性，应为（ 320+640）/2=480。 C5 红细胞凝集抑制实验 C5． 1 操作步骤 C5． 1． 1 血清中非特异抑制素的去除 受体破坏酶（ RDE）处理法： 1 容量血清，加 4 容量 RDE， 37℃ 水浴 16~18h，然后，置 56℃水浴 50min(以破坏残余的 RDE 活性 )；置 4℃保存待用，勿冻存。 经此法处理的人、鸡和山羊血清对甲、乙型流感病毒的非特异性抑制素均可完全去除。 RDE 处理对特异性抗体无影响。 但有时经处理的血清对测定的红细胞有非特异性凝集。 如发现时应在处理后血清中加入终浓度为 20%的浓的测定用红 细胞，摇匀，置室温 60min 或 4℃过夜， 1000r/min 离心 5min，收存上清。 对人血清抗体测定时，一般均经此步处理。 中国最大的管理资源中心 17 C5． 1． 2 四个血凝单位抗原的制备 四个血凝单位计算：将血凝单位除以 4，如表 1 中标本 1，它的四个血凝单位应为： 480/4=120，即将标本 1 进行 1： 120 稀释时，其稀释液就是含四个血凝单位。 配成后必须进行复核测定：取一块干净的大孔塑料板，在前三孔，也可任意连续的三孔，每孔加入 生理盐水，用一根 1ml 的吸管， 取 四个血凝单位的抗原放入第一孔，倍比稀释至第三孔， 吸出 弃之，然后每孔加入 ml 生理盐水，再加入 1%红细胞悬液，摇匀，置室温 30— 60 min后，观察结果。 正确结果，应第一孔出现 ++++，第二孔 ++，第三孔阴性或 +。 如太大或太小都得重新配置。 复核测定合格后，置 4℃ 或冰上，当天使用。 C5． 1． 3 血抑测定 C5． 1． 3． 1 取一干净的塑料板，标明测定血清标本，最后一孔为血清对照孔。 C5． 1． 3． 2 每孔加入 生理盐水。 C5． 1． 3． 3 于第一孔和最后一孔中各加入 ml 经 RDE 处理过的血清，从第一孔起作倍 比稀释至倒数第二孔，弃掉。 C5． 1． 3． 4 将最后一孔轻轻吹打后，亦弃掉。 C5． 1． 3． 5 于最后一孔加入 生理盐水，其余各孔一律加入 四个凝集单位抗原，轻轻摇匀，置室温 60 min。 C5． 1． 3． 6 各孔加入 1%的红细胞悬液，摇匀置室温 3060 min 后观察结果。 C5． 1． 3． 7 对照组 血清对照 血清 +生理盐水 血凝素对照 分别加入 4， 2， 1， 1/2 单位血凝素 +生理盐水0..25ml 红细胞对照 加生理盐水 以上各对照组再分别加入 1%的红细胞悬液 ，摇匀，在同等条件下观察结果。 C5． 2 结果判断 血凝的记录同血凝测定法，以能完全抑制红细胞凝集（简称血抑）的最高血清稀释度的倒数为血清抗体效价，即终点。 以表 2 为例，加以说明。 表 2 血抑测定结果 血清号 血清稀释度 效价 1： 10 1： 20 1： 40 1： 80 1： 160 1： 320 1： 640 1： 1280 1 — — — — — — ++++ ++++ 320 2 — — — — — + ++++ ++++ 280 3 — — — — — ++ ++++ ++++ 240 4 — — — — — +++ ++++ ++++ 200 5 — — — — — ++++ ++++ ++++ 160 6 — — — — — + +++ ++++ 320 7 — — — — — — — — ≥ 1280 8 ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ ++++ 10 或≤ 5 同样在计算抗体效价 之前，应对结果进行整理，方法同前。 如 6 中，必须把 中国最大的管理资源中心 18 1： 320 处的一个加号移到 1： 640 处，使 1： 320 处变成“ — ”，而 1： 640 处变成“ ++++”。 根据公式进行计算： X=Y+Y/4 Z X：血清效价 Y：能引起血凝全抑制最高血清稀释度的倒数 Z： 4减去不能被抑制数（全抑制高一个稀释度） 例如： 2号血清效价： X=Y+Y/4 Z=160+160/4（ 41） =280 C5． 3 交叉血抑测定和抗原比计算 为了确切了解抗原性变异的幅度，常用交叉血抑测定进行抗原分析。 测定中所用的免疫血清包括既往流行过的代表株和用新分离病毒制备的免疫血清。 所用抗原都是和血清相应的同株抗原。 每个抗原均必须准确调至四个单位，实验必须在同一条件下进行。 根据公式计算抗原比： R=√ r1 r2 r1=甲血清对乙抗原的血抑滴度 /甲血清对甲抗原的血抑滴度 r2=乙血清对甲抗原的血抑滴度 /乙血清对乙抗原的血抑滴度 R 为抗原比，当 R=1 时，表明两株间抗原性相同； R 时，表明两毒株间抗原性无明显差异； R 为 1/— 1/2 时表明两毒株的抗原性有小差异， R 值越大，差异越大。 附录 D （资料附录） 神经氨酸酶活性抑制试验 D1 反应原理： D1． 1 自由的 N乙酰神经氨酸（ Nacetylneuraminic acid）经神经氨酸酶的作用，自胎球蛋白（ Fetuin）底物中释放。 D1． 2 经过碘酸盐的氧化作用，将 N乙酰神经氨酸转化为 223。 甲酰丙酮酸（ βformyl pyruvic acid）。 D1． 3 223。 甲酰丙酮酸经硫代巴比妥酸的作用形成生色团。 D1． 4 用有机溶剂提取生色团，便可用分光光度计测定之，这样可测知标本中神经氨酸酶活性，并可选择用于神经氨酸酶抑制试验的标准剂量。 神经氨酸酶活性抑制实验是测定血清抑制标准量酶活性的效价。 NI 测定已成为流感病毒鉴定不可缺少的手段之一。 因 NI 测定结果是流感病毒神经氨酸亚型划分的主要依据之一。 有时该法也用于了解流感病毒 NA 抗原性变异和血清诊断等方面。 NI 测定不受血清中非特异性抑制素的影响，但易受病毒粒血凝素抗体的影响即空间干扰。 为解决这弊端，在流感病毒鉴定中 ，常使用单价血清（只针对 NA 的）或基因重配毒株所制备的免疫血清（如使基因重配株NA 抗原为 N2 或 N1，其 HA 抗原为马 1（ H7）亚型的）。 D2 材料 中国最大的管理资源中心 19 D2． 1 试剂配制 D2． 1． 1 磷酸缓冲液 甲液： 400mmol/L 正磷酸氢二钠 乙液： 400mmol/L 正磷酸二氢钠 丙液： 60 mmol/L 氯化钙 甲液 19 ml 加乙液 81 ml 混之，将 pH 调至 177。 ， pH 偏高用乙液调之，偏低用甲液调之。 而后加入 1 ml 丙液，此时 CaCl2的终浓度为 6 mmol/L。 置 4℃或室温保存。 注 ： 常常加入 CaCl2 后，缓冲液出现沉淀，故我们一般不加它。 甲、乙液为200 mmol/L。 D2． 1． 2 胎球蛋白 用蒸馏水把冰冻干燥的胎球蛋白配制成 4850mg/ml的溶液（让其缓慢溶解）。 或将冰冻保存的胎球蛋白溶液用去离子水配成工作液。 D2． 1． 3 过碘酸盐试剂 4． 28g过碘酸钠 (NaIO4)溶于 38ml 去离子水中，加 62 ml 浓正磷酸，充分混合，存于带玻璃塞的棕色瓶中。 D2． 1． 4 砷试剂 10 g 亚砷酸钠（ NaAsO4）和 g 无水硫酸钠加去离子水至 100 ml，混之，加 ml 浓硫 酸，使之完全溶解。 D2． 1． 5 硫代巴比妥酸试剂 g 硫代巴比妥酸和 g 无水硫酸钠加入去离子水至 200 ml，在沸水浴中加热溶解，用前新配，使用期为一周。 D2． 1． 6 生理盐水 NaCl 加入 100 ml 去离子水，溶解，置室温保存。 D2． 1． 7 酸化正丁醇试剂 95ml 正丁醇（ Butanol）中加入 5ml 浓盐酸，存在带塞棕色瓶中置室温保存。 D2． 1． 8 玻璃器材和煮锅等。 D3 操作步骤 D3． 1 神经氨酸酶活性测定 D3． 1． 1 病毒溶液用生理盐水作倍比稀释，一般新 鲜尿囊液抗原作 1： 2— 1：32 稀释已足够。 稀释好的病毒，每个稀释度加一管，。 于底物对照管中加入 (不加病毒 )。 D3． 1． 2 于每管中加入 的 PBS(因流感病毒神经氨酸酶最适 pH 为),每管中再加入 ml 胎蛋白溶液 ,充分混合后置 37℃水浴1618h。 注 :加每样试剂均应送至管底。 我们稀释病毒有时直接用 200 mmol/L 的 PBS,每管加 ,这样做不正规 ,但操作方便，对测定结果影响不大。 有些流感病毒株 NA活性很高， 于 37℃水浴 24h(与底物一起 )就可测出酶活性 . D3． 1． 3 从水浴中取出试管，放室温冷却，每管加入 过碘酸盐试剂，充分混合，置室温 20 min（这个时间要精确）。 D3． 1． 4 每管缓慢加入 1ml 砷试剂。 由于碘的释放出现棕色，摇荡试管待棕色 中国最大的管理资源中心 20 消失乳白色出现为止。 必要时试验可在此步暂停，测定物置 4℃冰箱保存。 其余测定步骤一律不能暂停）。 D3． 1． 5 每管加入 硫代巴比妥酸试剂，充分混合。 该试剂在煮沸溶解时趁热加入管中。 D3． 1． 6 立刻将试管置煮沸的水浴中煮 15min，此时所出现的红色 即为神经氨酸酶活性的反应。 D3． 1． 7 将试管置冰水中冷却，然后加入 4ml 酸化正丁醇，塞上干净的胶皮塞，用手剧烈摇荡 12min，使红色转到丁醇层。 D3． 1． 8 1500r/min 离心 5min,上层达到透明不混浊。 D3． 1． 9 将分光光度计波长调至 549nm，用底物对照管调零点，而后，从高稀释度到低稀释度，将管中的上层溶液吸置透光池中，依次测出并记录它们的吸光度 A 值（曾称光密度 OD 值）， A 值越高表明酶活性越强。 D3． 1． 10 一个酶单位确定：一般将 A 值为 的病毒稀释度作为一个酶单位。 我们常将 A 值为 的病毒稀释度为一个酶单位，用于酶活性抑制测定。 一个酶单位确定方法如下：将上述测到的数据作直线回归，找出 A 值为 的病毒稀释度。 但也可以下方法来确定： （ 1） 取一张半对数坐标纸，其纵轴（对数）表示病毒。