hplc培训教程(doc21)-管理培训(编辑修改稿)

hplc培训教程(doc21)-管理培训(编辑修改稿)内容摘要：

泵的液缸容积小，可至 ，因此易于清洗和更换流动相，特别适合于再循环和梯度洗脱；改变电机转速能方便地调节流量，流量不受柱阻影响；泵压可达 400 kg/cm2。 其主要缺点是输出的脉冲性较大，现多采用双泵系统来克服。 双泵按连接方式可分为并联式和串联式，一般说来并联泵的流量重现性较好（ RSD 为 %左右，串联泵为 ~%），但出故障的机会较多（因多一单向阀），价格也较贵。 各品牌输液泵的基本参数： 项目 Waters 515型 HP 1100型 LC10ATvp型 Elite P200 II型 检定要求 流速范围 ~10 ~10 ~ ~ 调节精度 流量精密度 % %（ %） % % % 流量准确度 177。 % 177。 % 177。 % 最高压力 4000 Psi 40 MPa 密封圈寿命 流动相的脉冲 2．泵的使用和维护注意事项 为了延长泵的使用寿命和维持其输液的稳定性，必须按照下列注意事项进行操作： ① 防止任何固体微粒进入泵体，因为尘埃或其它任何杂质微粒都会磨损柱塞、密封环、缸体和单向阀，因此应预先除去流动相中的任何固体微粒。 流动相最好在玻璃容器内蒸馏，而常用的方法是滤过，可采用 Millipore 滤膜（ amp。 micro。 m 或 amp。 micro。 m）等滤器。 泵的入口都应连接砂滤棒（或片）。 输液泵的滤器应经常清洗或更换。 ② 流动相不应含有任何腐蚀性物质，含有缓冲液的流动相不应保留在泵内，尤其 是在停泵过夜或更长时间的情况下。 如果将含缓冲液的流动相留在泵内，由于蒸发或泄漏，甚至只是由于溶液的静置，就可能析出盐的微细晶体，这些晶体将和上述固体微粒一样损坏密封环和柱塞等。 因此，必须泵入纯水将泵充分清洗后，再换成适合于色谱柱保存和有利于泵维护的溶剂（对于反相键合硅胶固定相，可以是甲醇或甲醇 水）。 ③ 泵工作时要留心防止溶剂瓶内的流动相被用完，否则空泵运转也会磨损柱塞、缸体或密封环，最终产生漏液。 ④ 输液泵的工作压力决不要超过规定的最高压力，否则会使高压密封环变形，产生企业 ()大量管理资料下载 漏液。 ⑤ 流动相应该先脱气，以免在泵 内产生气泡，影响流量的稳定性，如果有大量气泡，泵就无法正常工作。 如果输液泵产生故障，须查明原因，采取相应措施排除故障： ① 没有流动相流出，又无压力指示。 原因可能是泵内有大量气体，这时可打开泄压阀，使泵在较大流量（如 5ml/min）下运转，将气泡排尽，也可用一个 50ml 针筒在泵出口处帮助抽出气体。 另一个可能原因是密封环磨损，需更换。 ② 压力和流量不稳。 原因可能是气泡，需要排除；或者是单向阀内有异物，可卸下单向阀，浸入丙酮内超声清洗。 有时可能是砂滤棒内有气泡，或被盐的微细晶粒或滋生的微生物部分堵塞，这时，可卸 下砂滤棒浸入流动相内超声除气泡，或将砂滤棒浸入稀酸（如 4mol/L 硝酸）内迅速除去微生物，或将盐溶解，再立即清洗。 ③ 压力过高的原因是管路被堵塞，需要清除和清洗。 压力降低的原因则可能是管路有泄漏。 检查堵塞或泄漏时应逐段进行。 3．梯度洗脱 HPLC 有等强度 (isocratic)和梯度 (gradient)洗脱两种方式。 等度洗脱是在同一分析周期内流动相组成保持恒定，适合于组分数目较少，性质差别不大的样品。 梯度洗脱是在一个分析周期内程序控制流动相的组成，如溶剂的极性、离子强度和 pH 值等，用于分析组分数目多、性质差 异较大的复杂样品。 采用梯度洗脱可以缩短分析时间，提高分离度，改善峰形，提高检测灵敏度，但是常常引起基线漂移和降低重现性。 梯度洗脱有两种实现方式：低压梯度（外梯度）和高压梯度（内梯度）。 两种溶剂组成的梯度洗脱可按任意程度混合，即有多种洗脱曲线：线性梯度、凹形梯度、凸形梯度和阶梯形梯度。 线性梯度最常用，尤其适合于在反相柱上进行梯度洗脱。 在进行梯度洗脱时，由于多种溶剂混合，而且组成不断变化，因此带来一些特殊问题，必须充分重视： ① 要注意溶剂的互溶性，不相混溶的溶剂不能用作梯度洗脱的流动相。 有些溶剂在一定比例 内混溶，超出范围后就不互溶，使用时更要引起注意。 当有机溶剂和缓冲液混合时，还可能析出盐的晶体，尤其使用磷酸盐时需特别小心。 ② 梯度洗脱所用的溶剂纯度要求更高，以保证良好的重现性。 进行样品分析前必须进行空白梯度洗脱，以辨认溶剂杂质峰，因为弱溶剂中的杂质富集在色谱柱头后会被强溶剂洗脱下来。 用于梯度洗脱的溶剂需彻底脱气，以防止混合时产生气泡。 ③ 混合溶剂的粘度常随组成而变化，因而在梯度洗脱时常出现压力的变化。 例如甲醇和水粘度都较小，当二者以相近比例混合时粘度增大很多，此时的柱压大约是甲醇或水为流动相时的两倍。 因此 要注意防止梯度洗脱过程中压力超过输液泵或色谱柱能承受的最大压力。 ④ 每次梯度洗脱之后必须对色谱柱进行再生处理，使其恢复到初始状态。 需让 10~30倍柱容积的初始流动相流经色谱柱，使固定相与初始流动相达到完全平衡。 二、进样器 早期使用隔膜和停流进样器，装在色谱柱入口处。 现在大都使用六通进样阀或自动进样器。 进样装置要求：密封性好，死体积小，重复性好，保证中心进样，进样时对色谱系统的压力、流量影响小。 HPLC 进样方式可分为：隔膜进样、停流进样、阀进样、自动进样。 1．隔膜进样。 用微量注射器将样品注入专门设计的与色 谱柱相连的进样头内，可把样品直接送到柱头填充床的中心，死体积几乎等于零，可以获得最佳的柱效，且价格便宜，操作方便。 但不能在高压下使用（如 10MPa 以上）；此外隔膜容易吸附样品产生企业 ()大量管理资料下载 记忆效应，使进样重复性只能达到 1~2%；加之能耐各种溶剂的橡皮不易找到，常规分析使用受到限制。 2．停流进样。 可避免在高压下进样。 但在 HPLC 中由于隔膜的污染，停泵或重新启动时往往会出现 “ 鬼峰 ” ；另一缺点是保留时间不准。 在以峰的始末信号控制馏分收集的制备色谱中，效果较好。 3．阀进样。 一般 HPLC 分析常用六通进样阀（以美国 Rheodyne 公司的 7725 和 7725i型最常见），其关键部件由圆形密封垫（转子）和固定底座（定子）组成。 由于阀接头和连接管死体积的存在，柱效率低于隔膜进样（约下降 5~10%左右），但耐高压（ 35~40MPa），进样量准确，重复性好（ %），操作方便。 六通阀的进样方式有部分装液法和完全装液法两种。 ① 用部分装液法进样时，进样量应不大于定量环体积的 50%（最多 75％），并要求每次进样体积准确、相同。 此法进样的准确度和重复性决定于注射器取样的熟练程度，而且易产生由进样引起的峰展宽。 ② 用完全装液法进样时，进样量应不小 于定量环体积的 5~10 倍（最少 3倍），这样才能完全置换定量环内的流动相，消除管壁效应，确保进样的准确度及重复性。 六通阀使用和维护注意事项： ① 样品溶液进样前必须用 amp。 micro。 m 滤膜过滤，以减少微粒对进样阀的磨损。 ② 转动阀芯时不能太慢，更不能停留在中间位置，否则流动相受阻，使泵内压力剧增，甚至超过泵的最大压力；再转到进样位时，过高的压力将使柱头损坏。 ③ 为防止缓冲盐和样品残留在进样阀中，每次分析结束后应冲洗进样阀。 通常可用水冲洗，或先用能溶解样品的溶剂冲洗，再用水冲洗。 4．自动进样。 用于大量样品的常 规分析。 三、色谱柱 色谱是一种分离分析手段，分离是核心，因此担负分离作用的色谱柱是色谱系统的心脏。 对色谱柱的要求是柱效高、选择性好，分析速度快等。 市售的用于 HPLC 的各种微粒填料如多孔硅胶以及以硅胶为基质的键合相、氧化铝、有机聚合物微球（包括离子交换树脂）、多孔碳等，其粒度一般为 3,5,7,10μm 等，柱效理论值可达 5~16 万 /米。 对于一般的分析只需 5000 塔板数的柱效；对于同系物分析，只要 500 即可；对于较难分离物质对则可采用高达 2 万的柱子，因此一般 10~30cm 左右的柱长就能满足复杂混合物分析的需要。 柱效受柱内外因素影响，为使色谱柱达到最佳效率，除柱外死体积要小外，还要有合理的柱结构（尽可能减少填充床以外的死体积）及装填技术。 即使最好的装填技术，在柱中心部位和沿管壁部位的填充情况总是不一样的，靠近管壁的部位比较疏松，易产生沟流，流速较快，影响冲洗剂的流形，使谱带加宽，这就是管壁效应。 这种管壁区大约是从管壁向内算起 30 倍粒径的厚度。 在一般的液相色谱系统中，柱外效应对柱效的影响远远大于管壁效应。 1．柱的构造 色谱柱由柱管、压帽、卡套（密封环）、筛板（滤片）、接头、螺丝等组成。 柱管多用不锈钢制成，压力不高 于 70 kg/cm2 时，也可采用厚壁玻璃或石英管，管内壁要求有很高的光洁度。 为提高柱效，减小管壁效应，不锈钢柱内壁多经过抛光。 也有人在不锈钢柱内壁涂敷氟塑料以提高内壁的光洁度，其效果与抛光相同。 还有使用熔融硅或玻璃衬里的，用于细管柱。 色谱柱两端的柱接头内装有筛板，是烧结不锈钢或钛合金，孔径~20amp。 micro。 m(5~10amp。 micro。 m)，取决于填料粒度，目的是防止填料漏出。 色谱柱按用途可分为分析型和制备型两类，尺寸规格也不同： ① 常规分析柱（常量柱），内径 2~5mm（常用 ，国内有 4mm 和 5mm），柱长 10~30cm； ② 窄径柱（ narrow bore，又称细管径柱、半微柱 semimicrocolumn），内径 1~2mm，柱长 10~20cm； ③ 毛细企业 ()大量管理资料下载 管柱（又称微柱 microcolumn），内径 ~； ④ 半制备柱，内径＞ 5mm； ⑤ 实验室制备柱，内径 20~40mm，柱长 10~30cm； ⑥ 生产制备柱内径可达几十厘米。 柱内径一般是根 据柱长、填料粒径和折合流速来确定，目的是为了避免管壁效应。 2．柱的发展方向 因强调分析速度而发展出短柱，柱长 3~10cm，填料粒径 2~3amp。 micro。 m。 为提高 分析灵敏度，与质谱 (MS)联接，而发展出窄径柱、毛细管柱和内径小于 的微径柱（ microbore）。 细管径柱的优点是： ① 节省流动相； ② 灵敏度增加； ③ 样品量少； ④ 能使用长柱达到高分离度； ⑤ 容易控制柱温； ⑥ 易于实现 LCMS 联用。 但由于柱体积越来越小，柱外效应的影响就更加显著，需要更小池体积的检测器（甚至采用柱上检测），更小死体积的柱接头和连接部件。 配套使用的设备应具备如下性能：输液泵能精密输出 1~100amp。 micro。 l/min 的低流量，进样阀能准确、重复地进样微小体积的样品。 且因上样量小，要求高灵敏 度的检测器，电化学检测器和质谱仪在这方面具有突出优点。 3．柱的填充和性能评价 色谱柱的性能除了与固定相性能有关外，还与填充技术有关。 在正常条件下，填料粒度＞ 20amp。 micro。 m 时，干法填充制备柱较为合适；颗粒＜ 20amp。 micro。 m 时，湿法填充较为理想。 填充方法一般有 4 种： ① 高压匀浆法，多用于分析柱和小规模制备柱的填充；② 径向加压法， Waters 专利； ③ 轴向加压法，主要用于装填大直径柱； ④ 干法。 柱填充的技术性很强，大多数实验室使用已填充好的商品柱。 必须指出，高效液相色谱柱的获得，装填技术是重要环节，但根本 问题还在于填料本身性能的优劣，以及配套的色谱仪系统的的结构是否合理。 无论是自己装填的还是购买的色谱柱，使用前都要对其性能进行考察，使用期间或放置一段时间后也要重新检查。 柱性能指标包括在一定实验条件下（样品、流动相、流速、温度）下的柱压、理论塔板高度和塔板数、对称因子、容量因子和选择性因子的重复性，或分离度。 一般说来容量因子和选择性因子的重复性在 177。 5% 或 177。 10% 以内。 进行柱效比较时，还要注意柱外效应是否有变化。 一份合格的色谱柱评价报告应给出柱的基本参数，如柱长、内径、填料的种类、粒度、色谱柱的柱效、不对称 度和柱压降等。 4．柱的使用和维护注意事项 色谱柱的正确使用和维护十分重要，稍有不慎就会降低柱效、缩短使用寿命甚至损坏。 在色谱操作过程中，需要注意下列问题，以维护色谱柱。 ① 避免压力和温度的急剧变化及任何机械震动。 温度的突然变化或者使色谱柱从高处掉下都会影响柱内的填充状况；柱压的突然升高或降低也会冲动柱内填料，因此在调节流速时应该缓慢进行，在阀进样时阀的转动不能过缓（如前所述）。 ② 应逐渐改变溶剂的组成，特别是反相色谱中，不应直接从有机溶剂改变为全部是水，反之亦然。 ③ 一般说来色谱柱不能反冲，只有生产 者指明该柱可以反冲时，才可以反冲除去留在柱头的杂质。 否则反冲会迅速降低柱效。 ④ 选择使用适宜的流动相（尤其是 pH），以避免固定相被破坏。 有时可以在进样器前面连接一预柱，分析柱是键合硅胶时，预柱为硅胶，可使流动相在进入分析柱之前预先被硅胶 “ 饱和 ” ，避免分析柱中的硅胶基质被溶解。 ⑤ 避免将基质复杂的样品尤其是生物样品直接注入柱内，需要对样品进行预处理或者在进样器和色谱柱之间连接一保护柱。 保护柱一般是填有相似固定相的短柱。 保护柱可以而且应该经常更换。 企业 ()大量管理资料下载 ⑥ 经常用强溶剂冲洗色谱柱，清除保留在柱内的杂质。 在进行清 洗时，对流路系统中流动相的置换应以相混溶的溶剂逐渐过渡，每种流动相的体积应是柱体积的 20 倍左右，即常规分析需要 50~75ml。 下面列举一些色谱柱的清洗溶剂及顺序，作为参考：硅胶柱以正已烷（或庚烷）、二氯甲烷和甲醇依次冲洗，然后再以相反顺序依次冲洗，所有溶剂都必须严格脱水。 甲。