固定化细胞发酵(编辑修改稿)

固定化细胞发酵(编辑修改稿)内容摘要：

相比，固定化细胞表现生长稳定，降解能力强的优点。 4，处理重金属废水 由于微生物经固定化后，其稳定性增加，抗生物毒性物质的能力也大大增强，因此可以被广泛地用于各种有机废水中重金属离子的去除。 七、基因工程菌的固定化 游离细胞培养过程中出现的质粒高度不稳定性可能是由于如下原因：质粒的高拷贝数对细胞是有害的，并因此使具质粒细胞在与不具质粒细胞的竞争中处于劣势。 而固定化颗粒的物理性能，使得两种细胞间的竞争被极大地降低。 固定化基质中的微小区室使细胞经过有限 次的分裂形成小克隆， Nasri 等人发现无论接种量如何这些小克隆在释放到培养液中去之前只能繁殖 10～ 16 代，在此过程中即使出现 P细胞，也会由于延迟期的存在使其无法与 P＋ 细胞竞争而占据培养物中的大多数。 例如将具有 pTG201 和不具 pTG201 的 混合，游离培养后发现 P＋ 细胞很快消失，而共固定化后的培养则 P＋ 细胞和 P细胞能维持恒定比例达 80 代以上。 随着凝胶颗粒中细胞的生长，凝胶的刚性极大地降低，靠近凝胶颗粒表面的微孔破裂并将其中的细胞释放出来。 因此固定化生长细胞可被看成是一个免受 P细胞竞争的细胞 库。 除了限制细胞分裂次数外，质粒拷贝数的增加也使得质粒的稳定性提高， Sayadi 等的实验表明： (pTG201)固定化培养物中质粒拷贝数一直稳定在 250 左右。 电镜照片显示固定化细胞间存在紧密接触，似乎有可能由于质粒的转移而提高了工程菌的稳定性，通过将 和 细胞共固定化并培养后发现：没有细胞能在含有萘啶酮酸和氨苄青霉素的平板上生长，从而否定了固定化通过质粒转移提高质粒稳定性的可能。 因此，固定化培养细胞中质粒拷贝数的增加和凝胶中有限的细胞 分裂次数是提高质粒稳定性的基本因素 第十三章 基因工程菌的发酵 近年来，重组 DNA 技术 (基因工程 )已开始由实验室走向工业生产，走向实用。 它不仅为我们提供了一种极为有效的菌种改良技术和手段，也为攻克医学上的疑难杂症 —— 癌、遗传病及艾滋病的深入研究和最后的治愈提供了可能；为农业的第三次革命提供了基础；为深入探索生命的奥秘提供了有力的手段。 现在由工程菌产生的珍稀药物，如胰岛素、干扰素、人生长激素、乙肝表面抗原等等部已先后面市，基因工程不仅保证了这些药物的来源，而且可使成本大大下降。 但是从许多研究中发现，工程 菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，因而工程菌不稳定性的解决已日益受到重视并成为基因工程这一高技术成就转化为生产力的关键之一。 第一节 工程菌的来源和应用 一、何谓基因工程 基因工程 （ geic engineering）是指在基因水平上，采用与工程设计十分类似的方法，根据人们的意愿，主要是在体外进行基因切割、拼接和重新组合，再转入生物体内，产生出人们所期望的产物，或创造出具有新的遗传特征的生物类型，并能使之稳定地遗传给后代。 基因工程的核心技术是 DNA 的重组技术。 重组即利用供体生物的遗传物 质或人工合成的基因，经过体外或离体的限制酶切割后与适当的载体连接起来形成重组DNA 分子，然后在将重组 DNA 分子导入到受体细胞或受体生物构建转基因生物，该种生物就可以按人类事先设计好的蓝图表现出另外一种生物的某种性状。 除 DNA重组技术外，基因工程还应包括基因的表达技术，基因的突变技术，基因的导入技术等。 基因工程一般分为 4 个步骤： 一是取得符合人们要求的 DNA 片段，这种 DNA 片段被称为 “目的基因 ”；二是将目的基因与质粒或病毒 DNA 连接成重组 DNA；三是把重组 DNA 引入某种细胞；四是把目的基因能表达的受体细胞 挑选出来。 DNA 分子很小，其直径只有 20 埃，约相当于五百万分之一厘米，在它们身上进行 “手术 ”是非常困难的，因此基因工程实际上是一种 “ 超级显微工程 ” ，对 DNA 的切割、缝合与转运，必须有特殊的工具。 要把目的基因从供体 DNA 长链中准确地剪切下来，可不是一件容易的事。 1968 年，沃纳 阿尔伯博士、丹尼尔 内森斯博士和汉密尔 史密斯博士第一次从大肠杆菌中提取出了限制性内切酶，它能够在 DNA 上寻找特定的 “切点 ”，认准后将 DNA 分子的双链交错地切断。 人们把这种限制性内切酶称为 “分子剪刀 ”。 这种 “分子剪刀 ”可 以完整地切下个别基因。 自 70 年代以来，人们已经分离提取了 400 多种 “分子剪刀 ”。 有了形形色色的 “分子剪刀 ”，人们就可以随心所欲地进行 DNA 分子长链的切割了。 DNA 的分子链被切开后，还得缝接起来以完成基因的拼接。 1976 年，科学们在 5个实验室里几乎同时发现并提取出一种酶，这种酶可以将两个 DNA 片段连接起来，修复好 DNA 链的断裂口。 1974 年以后，科学界正式肯定了这一发现，并把这种酶叫作 DNA 连接酶。 从此， DNA 连接酶就成了名符其实的 “缝合 ”基因的 “分子针线 ”。 只要在用同一种 “分子剪刀 ”剪切的两种 DNA 碎片中加上 “分子针线 ”，就会把两种DNA 片段重新连接起来。 把 “拼接 ”好的 DNA 分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种分子小、能自由进出细胞，而且在装载了外来的 DNA 片段后仍能照样复制的运载体。 理想的运载体是质粒，因为质粒能自由进出细菌细胞，应当用 “分子剪刀 ”把它切开，再给它安装上一段外来的 DNA 片段后，它依然如故地能自我复制。 有了限制性内切酶、连接酶及运载体，进行基因工程就可以如愿以偿了。 运载体将目的基因运到受体细胞是基因工程的最后一步，目的基因的导入过程是肉眼看不到的。 因此，要知道导入是否成功，事先应 找到特定的标志。 例如我们用一种经过改造的抗四环素质粒 PSC100 作载体，将一种基因移入自身无抗性的大肠杆菌时，如果基因移入后大肠杆菌不能被四环素杀死，就说明转入获得成功了。 二、工程菌的获得 1，确定目的产物。 2，找出产该产物的细胞。 3，将细胞破碎后提纯出全部信使 RNA。 这些信使中包含了该细胞内表达的所有蛋白质的合成信息。 4，利用基因扩增技术（ PCR），找出所需的目的基因。 5，将目的基因连接到设计好的质粒载体，形成了重组 DNA 分子。 6，将重组后 DNA 分子引入到受体细胞内，然后选择合适的培养条 件使细胞繁殖。 根据选择性标记，从菌落中筛选出目的基因的重组 (工程 )菌。 三、工程菌应具备的条件 1，发酵产品是高浓度、高转化率和高产率的，同时是分泌型菌株。 2，菌株能利用常用的碳源，并可进行连续发酵。 3，菌株不是致病株，也不产内毒素。 4，代谢控制容易进行。 5，能进行适当的 DNA 重组，并且稳定，重组的 DNA 不易脱落。 四、工程菌的应用 1，基因药物 例如，红细胞生成素、胰岛素、干优素、乙肝疫苗、生长激素和粒细胞巨噬细胞集落刺激因子等。 2，其它发酵产品 例如酶制剂、氨基酸（苏氨酸、色氨酸）、抗生素 等。 第二节 工程菌的培养 就生产流程而言，从发酵到分离、纯化目标产物，工程菌和常规微生物并无太多的差异。 但工程菌在保存过程中及发酵生产过程中表现出不稳定性，以及安全性等问题，使得工程菌的培养有着自身所特有的特点。 一、安全问题 关于基因工程的社会问题，必须提到它的潜在危险性。 经过重组的菌和质粒一旦用于，工业化生产，就不可避免地进入自然界。 这些菌能间接地危害人体健康，使治疗药物失去效用，污染环境等。 因此，安全问题是极其重要的。 1974 年，提出了 DNA 重组实验具有潜在生物危险性的问题。 后 来，美、日等国都制定了有关 DNA 重组实验的准则，即在试管内用酶等构建异种 DNA 的重组分子，并用它转入活细胞中的实验，以及使用重组体的实验应遵循的规程。 其目的是保证实验的安全和推动重组 DNA 的研究。 这些准则参照了防止病原微生物污染的措施，以及根据对实验安全度的评定，采用物理密封 (P1~P4)和生物学密封 (B1 和 B2)两种方法。 物理密封是将重组菌封闭于设备内，以防止传染给实验人员和向外界扩散。 实验规模在 20L以下时，物理密封由密封设施、实验室设计和实验注意事项组成。 密封程度分为 P P P3 和 P4 级，数字越大，密封水平越高。 生物学密封要求用只有在特殊培养条件下才能生存的宿主，同时用不能转移至其它活细胞的载体，通过这样组合的宿主载体系统，可以防止重组菌向外扩散。 按密封程度分 B1 和 B2 级，B2 级的密封要求最严格。 企业中进行重组菌培养时的设备标准有 LS1 和 LS2。 LS2 相当严格，工业生产起码应在 LS1 的设备标 准下培养。 LS1 标准要点是： (1)使用防止重组菌体外漏，能在密闭状态下进行内部灭菌的培养装置； (2)培养装置的排气由除菌器排出； (3)使用易产气溶胶的设备时，要安装可收。