生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程(编辑修改稿)

生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程(编辑修改稿)内容摘要：

的细胞系 /株，则应检测如人鼻咽癌病毒、人巨细胞病毒、人逆转录病毒、人乙型肝炎病毒、人丙型肝炎病毒。 在某些情况下，也可能进行转化病毒的检测，如人乳头瘤病毒、腺病毒及人单纯疱疹病毒。 这些病毒的检测可采用适当的体外检测技术。 5 致瘤性检查 某些传代细胞系已证明具有致瘤性，如来源于啮齿类的细胞系 BHK21， CHO，C127 细胞等，或细胞类型属致瘤性细胞，如杂交瘤细胞，则可不必作致 瘤性检查。 某些传代细胞系已证明在一定代次内不具有致癌性，而超过某代次则具有致瘤性，如 VERO 细胞，则必须进行致瘤性检查。 人上皮细胞系、人二倍体细胞株及所有用于活病毒疫苗生产的细胞系 /株应进行致瘤性检查。 另外，新建细胞系 / 株必须进行致瘤性检查。 在某些情况下，用于人体细胞治疗及基因治疗的细胞也须进行致瘤性检查。 将 MCB 或 WCB 的细胞增殖到或超过生产用体外细胞龄限制代次，再进行致瘤性试验。 ” 下述两种致癌性试验方法可任选其一： ①裸鼠 至少 10 只，将细胞悬浮于适量无血清培养基中，使细胞浓度为 5107个 细胞 /ml，每只裸鼠皮下或肌内注射 ；同时用 Hela 或 Hep2 细胞设立阳性对照，阳性对照组至少 10 只，每只注射 含 106个细胞；可用人二倍体细胞株作为阴性对照，阴性对照组至少 10 只，每只注射 含 1067个细胞。 ②新生小鼠 (3~5 日龄 )， 8~10g 小鼠 10 只，在出生后第 0 天、 2 天、 7 天和第 14 天，分别用 抗胸腺血清 (ATS)或球蛋白处理，然后同上每只皮下接种107活细胞。 并设立阳性对照组，对照组至少接种 10 只。 结果判定： ① 定期观察并触摸注射部位有无结节形成，且形成的 任何结节均应进行双向测量并记录。 ② 阳性对照组应至少有 9 只有进行性肿瘤生长时，试验视为有效。 ③ 如试验组动物有进行性生长的结节或可疑病灶，应观察至少 1~2 周；若出现的结节在观察期内开始消退，则应在结节完全消退前，处死动物并进行解剖作病理及组织学检查。 ④未发生结节的动物半数应观察 21 天，剖检，另外半数动物应观察 12 周，进行病理检查，剖检接种部位，观察各淋巴结和各器官有无结节形成，如有怀疑，进行病理组织检查，不应有转移瘤形成。 除上述体内法外，也可采用软琼脂克隆形成试验或器官培养试验等体外法检测，特别适用于在低代 次时在动物体内无致瘤性的传代细胞系。 （四）生产用细胞培养 生产用原材料的选择和细胞操作环境应符合本规程‘细胞库的建立’中有关规定。 从冻存的 WCB 中取出一支或多支安瓿，混合后培养，传至一定代次后供生产用。 其代次不得超过该细胞用于生产的最高限定代次。 生产用细胞的最高限定代次应根据研究结果确定，但不得超过国际认可的最高限定代次。 从 WCB 取出的细胞种子增殖的细胞不得再回冻保存后而再用于生产。 体外培养细胞龄的计算 二倍体细胞龄以细胞群体倍增（ Population Doubling）计算，以每个培养容器 细胞群体细胞数为基础，每增加一倍作为一世代，即一瓶细胞传二瓶 (1:2分种率 )，再长满瓶为一世代；一瓶传四瓶 (1:4)为二世代；一瓶传八瓶 (1:8)则为三世代。 生产用细胞龄限制在细胞寿命期限的前 2/3 内。 传代细胞系则以一定稀释倍数进行传代，每传一次为一代。 二、 连续传代细胞系的特殊要求 传代细胞系一般是由人或动物肿瘤组织或正常组织传代或转化而来，可悬浮培养或采用载体培养，能大规模生产。 这些细胞可无限传代，但到一定代次后，致瘤性会增强。 所以对生产用传代细胞系应进行严格检查。 应按 本规程‘细胞的检定’ 的规定进行细胞库的检查。 对生产过程中细胞培养的要求如下： 1．用于生产的细胞代次 用于生产的传代细胞系，生产代次应有一定限制。 用于生物制品生产的细胞最高限定代次，须经批准。 2．生产过程中细胞培养物检查： 对于病毒类制品， 在生产末期，应按照本规程中的三 .6（ 2）、（ 3）、（ 4）和（ 5）对生产对照用细胞进行检查，并合格。 对于在不同 时间收集合并的培养物，应在每次收集时检测对照细胞培养物。 三、人二倍体细胞株的特殊要求 新建的人二倍体细胞 必须具有以下资料：建立细胞株所用胎儿的胎龄和性别、终止妊娠的原因、所用胎 儿父母的年龄、职业及健康良好的证明（医师出具的健康状态良好、无潜在性传染病和遗传性疾患等证明），以及胎儿父系及母系三代应无明显遗传缺陷疾病历史的书面调查资料。 人二倍体细胞株应在传代过程的早期，选择适当世代水平（ 28 世代）增殖出大量细胞，定量分装后，置液氮中或 – 130℃下冻存，供建立 PCB 之用，待全部检定合格后，即可正式定为 PCB，供制备 MCB 用。 1．染色体检查及判定标准 新建人二倍体细胞株及其细胞库必须进行染色体检查。 对于已建株的人二倍体细胞株，如 WI3 MRC 2BS， KMB17 等，在建立 MCB 时可不必进行细胞染色体检查。 但如对细胞进行了遗传修饰，则须按新建细胞株进行染色体检查。 （ 1）染色体检查 新细胞建株过程中，每 8~12 世代应作一次染色体检查，一株细胞整个生命期内连续培养过程中，至少应有 4 次染色体检查结果。 每次染色体检查，应至少随机取 1000 个分裂中期细胞，进行染色体数目、形态和结构检查，并作记录以备复查。 其中至少选择 50 个分裂中期细胞进行显微照相，作出核型分析，并应粗数 500 个分裂中期细胞，检查多倍体的发生率。 每次染色体检查，应从同一世代的不同培养瓶中取细胞，混合后进行再培养，制备 染色体标本片。 染色体片应长期保存，以备复查。 可用 G 分带或 Q 分带技术检查 50 个中期细胞染色体带型，应用照相图片作出带型分析。 （ 2）判定标准 对 1000 个和 500 个中期细胞标本异常率进行检查，合格的上限 (可信限 90% Poison 法 )如表 2。 表 2 人二倍体细胞染色体分析标准 检查细胞数 异 常 1000 500 100 染色单体和染色体断裂 47 26 8 结构异常 17 10 2 超二倍体 8 5 2 亚二倍体 * 180 90 18 多倍体 ** 30 17 4 *。