生产菌种的扩大培养与保藏(编辑修改稿)

生产菌种的扩大培养与保藏(编辑修改稿)内容摘要：

程中菌体的生长，发 酵参数（培养基，培养条件等）和产物形成速率三者间的关系。 把它们随时间变化的过程绘制成图，就成为所说的代谢曲线。 发酵过程按进行过程有三种方式： （ 1）分批发酵 (Batch fermentation) （ 2）补料分批发酵 (Fedbatch fermentation) （ 3）连续发酵 (Continuous fermentation) 本节主要介绍分批发酵、补料分批发酵及连续发酵三种类型的操作方式下的代谢特征。 一、分批发酵 分批发酵的定义 是指在一封闭系统内含有初始限量基质的发酵方式。 在这一过程中，除了氧气、消泡剂及控制pH 的酸或碱外，不再加入任何其它物质。 发酵过程中培养基成分减少，微生物得到繁殖。 分批发酵的特点 微生物所处的环境在发酵过程中不断变化，其物理，化学和生物参数都随时间而变化，是一个不稳定的过程。 分批发酵的优缺点 优点： 操作简单； 操作引起染菌的概率低。 不会产生菌种老化和变异等问题 缺点： 非生产时间较长、设备利用率低。 分批发酵的生长曲线 单细胞微生物的生长曲线 （ 2）丝状真菌的生长曲线 在液体振荡培养 (或深层通气培养 )中， 以菌丝干重作为衡量生长的指标，可获得如图所示的生长曲线。 在静止培养中也可获得类似的生长曲线。 丝状真菌的生长过程大致可分为；①生长延滞期；②迅速生长期；③衰退期。 ①生长延滞期 造成生长延滞的原因有两种：一是孢子萌发前的真正的延滞期，另一种是生长已开始但却无法测量。 对真菌的生长延滞期尚未作过仔细研究。 ②迅速生长期 此时菌丝体干重迅速增加，其立方根与时间成直线关系。 因为真菌不是单细胞，其繁殖不以几何倍数增加，故而没有对数生长期。 真菌的生长常表现为菌丝尖端的生长和菌丝的分枝，因此受到邻近细胞竞争营养物 质的影响。 尤其在静止培养时，许多菌丝在空气中生长，必须从邻近的细胞吸收营养物质供生长需要，在迅速生长期中，碳、氮、磷被迅速利用，呼吸强度达到顶峰，代谢产物如酸类可出现或不出现。 静止培养时，在迅速生长期的后期的菌膜上格出现孢子。 ③衰退期 真菌生长进入衰退期的标志，是菌丝干重下降。 一般是在一短期内失重很快，以后不再变化。 但有些真菌则发生菌丝体自溶，由于其自身所产生的酶类催化几丁质、蛋白质、核酸等分解而释放出氨、游离氨基酸、有机磷化物和有机硫化合物等。 处于衰退期的菌丝体的细胞，除顶端较幼细胞的原生质比较稠密均匀 外，大多数细胞都出现大的空泡。 生长的停止由以下两种因素之一所决定。 在高浓度培养基中，可能是因为有毒代谢产物的积累而阻碍生长，如在高浓度碳水化合物的培养基中可积累有机酸；在含有机氮高的培养基中可积累氨。 多数次生物质，如抗生素等，也是在此时合成的。 在较稀释的、营养物质平衡良好的培养基中，生长停止的主要因素是碳水化合物的耗尽。 当生长停止后，菌丝体的自溶裂解的程度，因菌种的本性和培养条件而导。 分批发酵的类型 通常有两种分类方式： （ 1） Gaden39。 s fermentation classification（按照菌体生长，碳源利用和产物生成的变化） ①第一类型（生长关联型） 产物直接来源于产能的初级代谢（自身繁殖所必需的代谢），菌体生长与产物形成不分开（见下图）。 例如单细胞蛋白和葡萄糖酸的发酵。 其动力学方程为： ②第二类型（部分生长关联型） 产物也来源于能量代谢所消耗的基质，但产物的形成在与初级代谢分开的次级代谢中，出现两个峰，菌体生长进入稳定期，出现产物形成高峰（见下图）。 例如，柠檬酸和某些氨基酸的发酵。 其动力 学方程为 ③第三类型 产物是在基质消耗和菌体生长之后，菌体利用中间代谢反应来形成的，即产物的形成和初级代谢是分开的（见下图）。 如抗生素发酵。 其动力学方程为： （ 2） Piret39。 s fermentation classification （按照产物生成与菌体生长是否同步） ①生长关联型 (第一类型 ) 形成与生长有关，如酒精、某些酶等。 ：产物合成的比速率菌体）产物成比例（：生长关联型产物的形或PX d tdPPdtdPggx/XdtdPPdtdPQ XXXdtdPPdtdPQ X 其动力学方程为： ②生长无关联型（第二，三类型） 产物的形成速度与生长无关，只与细胞积累量有关。 如，抗生素。 杀念珠菌素发酵中葡萄糖、 DNA、抗生素产量的代谢变化 A： DNA； B：葡萄糖； C：杀念珠菌素产量 6，分批发酵的分类对实践的指导意义 从上述分批发酵类型可以分析：如果生产的产品是生长关联型（如菌体与初级代谢产物），则宜采用有利于细胞生长的培养条件，延长与产物合成有关的对数生长期；如果产品是非生长关联型（如次级代谢产物），则宜缩短对数生长期，并迅速获得足够量的菌体细胞后延长平衡期，以提高产量。 7，典型的分批发酵工艺流程 ）：比生长速率（）物的率（：菌体生长为基准的产）产物形成比速率（hYQYQggLhgxPPxPP1////: 二、补料分批 发酵 定义 补料分批发酵又称半连续发酵或流加分批发酵，是指在分批发酵过程中，间歇或连续地补加新鲜培养基的发酵方式。 补料分批发酵的优缺点 优点： 使发酵系统中维持很低的基质浓度； 和连续发酵比、不需要严格的无菌条件； 不会产生菌种老化和变异等问题。 缺点： 存在一定的非生产时间； 和分批发酵比，中途要流加新鲜培养基，增加了染菌的危险。 补料分批发酵的类型 按补料方式不同可分为： （ 1）连续流加 （ 2）不连续流加 （ 3）多周期流加 按补料成分的不同可分为： （ 1）单一组 分流加 （ 2）多组分流加 按控制方式的不同可分为： （ 1）反馈控制 （ 2）无反馈控制 四、连续发酵 定义 培养基料液连续输入发酵罐，并同时放出含有产品的相同体积发酵液，使发酵罐内料液量维持恒定，微生物在近似恒定状态（恒定的基质浓度、恒定的产物浓度、恒定的 pH、恒定菌体浓度、恒定的比生长速率）下生长的发酵方式。 连续发酵的优缺点 优点： 能维持低基质浓度； 可以提高设备利用率和单位时间的产量； 便于自动控制。 缺点： 菌种发生变异的可能性较大； 要求严格的无菌条件。 连续发酵 的类型 （ 1）恒化培养 使培养基中限制性基质的浓度保持恒定 （ 2）恒浊培养 使培养基中菌体的浓度保持恒定 连续发酵的代谢曲线 X：菌体浓度； S：限制性基质浓度； t：时间 第二节 发酵工艺的控制 工艺条件控制的目的：就是要为生产菌创造一个最适的环境，使我们所需要的代谢活动得以最充分的表达。 一、温度对发酵的影响及控制 1，影响发酵温度的因素 （ 1）产热因素：生物热和搅拌热。 （ 2）散热因素：蒸发热和辐射热。 2，发酵热 发酵热就是发酵过程中释放出来的净热量。 Q 发 酵 =Q 生物 +Q 搅拌 Q 蒸发 Q 辐射 （ 1）生物热： 定义：生物热是生产菌在生长繁殖时产生的大量热量。 培养基中碳水化合物，脂肪，蛋白质等物质被分解为 CO2,NH3 时释放出的大量能量。 用途：合成高能化合物，供微生物生命代谢活动，热能散发。 影响生物热的因素：生物热随菌株，培养基，发酵时期的不同而不同。 一般，菌株对营养物质利用的速率越大，培养基成分越丰富，生物热也就越大。 发酵旺盛期的生物热大于其他时间的生物热。 生物热的大小还与菌体的呼吸强度有对应关系。 实验发现抗生素高产量批号的生物热高于低产量批号的生物热。 说 明抗生素合成时微生物的新陈代谢十分旺盛。 发酵过程中生物热的变化 在四环素发酵中，还发现生物热和菌的呼吸强度的变化有对应关系，特别是在 80小时以前。 从此实验中还可看到，当产生的生物热达到高峰时，糖的利用速度也最大。 另外也有人提出，可从菌体的耗氧率来衡量生物热的大小。 四环素生物合成过程中系列参数的动态变化过程 1：效价； 2：呼吸强度； 3：生物热； 4：糖浓度 （ 2）搅拌热 定义：通风发酵都有大功率搅拌，搅拌的机械运动造成液体之间，液体与设备之间的摩 擦而产生的热。 搅拌热的计算： Q 搅拌 =3600（ P/V） 式中 3600：热功当量（ kJ/（ ）） 抗生素相对活性为 1 抗生素相对活性为 （ P/V）：通气条件下单位体积发酵液所消耗的功率（ kW/m3） （ 3）蒸发热 定义：通入发酵罐的空气，其温度和湿度随季节及控制条件的不同而有所变化。 空气进入发酵罐后，就和发酵液广泛接触进行热交换。 同时必然会引起水分的蒸发；蒸发所需的热量即为蒸发热。 蒸发热的计算： Q 蒸发 =G（ I2I1） 式中 G：空气流量，按干重计算， kg/h I1 、 I2 ：进出发酵 罐的空气的热焓量， J/kg（干空气） （ 4）辐射热 定义：由于发酵罐内外温度差，通过罐体向外辐射的热量。 辐射热的计算：辐射热可通过罐内外的温差求得，一般不超过发酵热的 5%。 3，发酵热的测定 （ 1）通过测定一定时间内冷却水的流量和冷却水进出口温度，由下式求得这段时间内的发酵热。 （ 2）通过罐温的自动控制，先使罐温达到恒定，再关闭自控装置测得温度随时间上升的速率 S，按下式可求得发酵热： 4，温度对发酵的影响 温度通过以下方式影响发酵过程 （ 1）影响各种酶的反应速率和蛋白质性 质 （ 2）影响发酵液的物理性质 （ 3）影响生物合成的方向。 例如，四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。 在低于 30℃温度下，该菌种合成金霉素能力较强。 当温度提高，合成四环素的比例也提高。 在温度达 35℃则只产生四环素而金霉素合成几乎停止。 发酵过程中，微生物生长速率变化 dX/dt =μ Xα X 式中 μ：比生长速率 α：比死亡速率 当处于生长状态时，μ α，α可忽略。 μ与 α与温度有关 根据 Arrenhnius 公式 μ = AeE/RT α = A’eE’/RT 通常 E’大于 E，所以 α比 μ对温度变化更为敏感。 例：青霉菌生产青霉素 青霉菌生长活化能 E=34kJ/mol 青霉素合成活化能 E=112kJ/mol 青霉素合成速率对温度较敏感，温度控制相当重要。 5，最适温度的确定 在发酵过程中，最适温度是一种相对概念，是指在该温度下最适于菌的生长或发酵产物的生成。 最适发酵温度与菌种，培养基成分，培养条件和菌体生长阶段有关。 最适发酵温度的选择：在发酵的整个周期内仅选一个最适培养温度不一定好。 温度的选择要参考其它发酵条件。 温度的选择还应考虑培养基成分和浓度 6， 温度的控制 发酵罐：夹套（ 10M3 以下） 盘管（蛇管） （ 10M3 以上） 二、 pH 对发酵的影响及控制 发酵过程中培养液的 pH 值是微生物在一定环境条件下代谢活动的综合指标，是一项重要的发酵参数。 它对菌体的生长和产品的积累有很大的影响。 因此，必须掌握发酵过程中 pH 的变化规律，及时监测并加以控制，使它处于最佳的状态。 尽管多数微生物能在 3~4 个 pH 单位的 pH范围内生长，但是在发酵工艺中，为了达到高生长速率和最佳产物形成，必须使 pH 在很窄的范围内保持恒定。 1， pH 值对微生物的生长繁殖和产物 合成的影响 pH 通过以下方式影响发酵过程： （ 1） pH 影响。