食用菌多糖抗氧化性的研究(编辑修改稿)

食用菌多糖抗氧化性的研究(编辑修改稿)内容摘要：

而影响多糖提取率的高低。 为解决这个问题我们在提取过程中可采用正交实验方法通过排除或减少干扰因素，确定最佳提取方法，提高食用菌多糖的提取率。 多糖的抗氧化性 多糖抗氧化作用的机制 近几年来，随着自由基生物学与自由基医学研究的迅速发展，现已证明多种疾病的发生和发展与自由基对组织细胞的损伤关系密切 [16]。 如果自由基的产生和清除失衡，就会对机体造成损伤，导致疾病。 大量研究表明多糖具有抗氧化性，但是对于多糖抗氧化性的机理现在才刚刚起步，有些机理还不甚明确，人们认为多糖的抗氧化性机理可能与以下几种情况有关： （ 1）多糖分子间接作用与自由基本身。 具体又可以分为两种： ① 多糖直接作用于抗氧化酶。 通过提高体内原有抗氧化酶如： SOD， CAT， GSH2Px等的活性，间接发挥抗氧化作用。 ② 多糖分子络合产生活性氧所必需的金属离子。 多糖结构中的醇羟基可以与产生 •OH 等自由基所必需的金属离子（如 Fe2+， Cu2+等）络合，使羟基自由基的产生受到抑制，进而影响脂质过氧化的启动，最终抑制活性氧的产生 [17]（ 2）多糖分子直接作用于自由基本身。 对于脂质过氧化而言，多糖分子可以直接捕获脂质过氧化链式反应中产生的活性氧，阻断或减缓脂质过氧化的进行；对于 •OH而言，多糖碳氢链上的氢原子可以与其结合成水，达到清除 •OH的目的，而多糖的碳原子则因此成为碳自由基，并进一步氧化形 成过氧自由基，最后分解成对机体无害的产物；对于超氧阴离子自由基而言，多糖可与其发生氧化反应，达到清除的目的 [18]。 清除羟基自由基活性分析方法 目前国内外对有关 •OH的分析测定方法有许多报道，关于 •OH的分析一般是通过一定的体系产生 •OH，再用一些方法来测定反应产生的 •OH，产生 •OH的体系有 Fe3+—EDTA—抗坏血酸 —H2O2体系， Fe2+—EDTA—H2O2体系，抗坏血酸 —Cu2+—H2O2体系和黄嘌呤 —黄嘌呤氧化酶 —H2O2体系及紫外光照 H2O2光解产生 •OH等 [18~23]。 测定 •OH 的方法主要有电子自旋共振法，高效液相色谱法，化学发光法，荧光分析法和分光光度法 [33]。 电子自旋共振法和高效液相色谱法测定 •OH，虽然灵敏度较高，但是所需仪器昂贵，操作也比较复杂，一般实验室难以应用。 化学发光法操作简便，不需要昂贵的仪器，测定快速。 曾有人 [24]用化学发光法测定抗坏血酸 —Cu2+—H2O2体系产生的 •OH。 荧光分析法灵敏度同样很高而且仪器也较化学发光法普及，徐向荣等 [25]采用 Ce3+荧光分析法测定 Fenton反应产生的 •OH，该法简便实用，测定快速。 与以上方法相比应用最广泛最普及的还是 分光光度法，李平等 [26]利用分光光度法检测各种自由基清除剂对Fe2+—EDTA—H2O2体系产生的 •OH的清除作用。 其原理是 Fenton 反应是经典的产生 •OH的体系，可认为能模拟人体内产生 •OH的过程，该反应是以双氧水为氧化剂，在亚铁盐作用下的氧化反应： Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + •OH + OH— 反应产生的羟基可以氧化番红使其褪色，利用分光光度法检测吸光度变化间接测定所产生的羟自由基。 在加入 H2O2前加入羟基自由基清除剂， Fenton 反应产生的羟自由基被清除或部分清除， 体系在 520nm 波长处的吸光度降低程度相应减少，采用固定反应时间法，在 520nm 波长处测量被测物反应液的吸光度并与空白液比较，从而测定被测物对 •OH的清除作用。 用番红与羟自由基反应的光度测定法，李平等利用分光光度法测定过山茱萸多糖清除羟自由基的能力，但是由于反应体系中 H2O2含量过高，使实验结果误差很大，为此我们通过试验对该方法进行了改进，确定了最佳反应条件。 清除超氧阴离子自由基活性分析方法 对于超氧阴离子自由基（ O2•—）分析测定方法与 •OH的分析方法相似，一般也是通过 产生超氧阴离子自由基（ O2•—）的体系产生 O2•—，然后再通过各种方法测定 O2•—， 产生超氧阴离子自由基（ O2•—）的体系有黄嘌呤 —黄嘌呤氧化酶—碱性 DMSO，甲硫酸非那宗 —NADPH[27， 28]和邻苯三酚自氧化法 [29， 30]。 测定 •OH 的方法同样适用于测定 O2•—，另外还有脉冲辐射法、比色法、单扫描极谱法 [31]、氧电极法 [32]等一些间接测定方法。 由于实验方法需要仪器设备或条件特殊，一般难以满足，所以测定 O2•—最常用的方法还是分光光度法。 一般是利用分光光度法检测邻苯三酚自氧化产物从而间接测定反应产生的 O2•—，进而研 究 O2•—清除剂的清除 O2•—能力。 其反应原理是：利用邻苯三酚自氧化反应，测定加入自由基清除剂对产生的 O2•—清除作用。 邻苯三酚在弱碱性（ TrisHClEDTA 缓冲液 PH=⒏ 2）环境中自氧化分解产生 O2•—的反应 邻苯三酚 O2•— + 其他产物 随着反应的进行， O2•—在体系中不断积累，致使反应液在 320nm， 325nm，440nm 波长的吸光度在反应开始一段时间内随时间变化而线性增长，通过测定邻苯三酚自氧化系统的吸收光谱，确定自氧化速率最大值及最大吸收波长为325nm[29]，在此条件下，测定加入自由基清除剂反应的吸收光谱确定自氧化速率，各系统的自氧化速率为 S，清除率为 E。 另外人们模拟人体黄嘌呤与黄嘌呤氧化酶产生 O2•—的原理研制出了抗超氧阴离子自由基试剂盒，应用起来更方便。 2 实验部分 材料与试剂 香菇（新鲜市售），东北黑木耳（干，市售），裙带菜（干，市售），真姬菇（市售），真姬菇纯化多糖（ ZJ2），番红为生化试剂，乙醇，丙酮，邻苯三酚， L—抗坏血酸（ Vc），双氧水，三羟甲基胺基甲烷，磷酸盐， EDTANaFe（ Ⅱ ）等试剂均为国产分析纯。 仪器设备 UV—4802 型紫外可见分光光度计，尤尼柯（上海）仪器有限公司）； SK3200H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司； ZHT 型自动恒温电热套，山东鄄城永兴仪器厂； WC/0905 超级恒温箱；恒温水浴锅； FC204 电子天平等 实验方法 粗多糖的制备 称取干燥的真姬菇 10g 粉碎，研磨，置于烧杯中加 40 倍的蒸馏水，混匀，超声波 15min 后于 90℃ 恒温水浴锅中搅拌浸提 3h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，残渣以同样的方法提取，合并两次提取液，浓缩至原来体积的三分之一，将浓缩液加到三倍体积的无水乙醇中醇沉 24 小时，减压抽滤，沉淀物依次用 95%乙醇，丙酮洗涤， 60℃ 烘箱干燥，即得到真姬菇粗多糖。 将新鲜香菇撕碎烘干，称取 9g，粉碎，置于烧杯中加入 20 倍体积的蒸馏水混匀，在 80℃ 恒温水浴锅中搅拌浸取 5h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩至原来体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于 60℃ 烘箱中干燥称重，得香菇粗多糖。 称取干木耳 10g，粉碎，置于烧杯中加 60 倍体积的蒸馏水，混匀在 80℃ 水浴锅中搅拌浸取 4h，减压抽滤，提取液置于烧杯中，浓缩至原体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于 60℃ 烘箱中干燥称重，得木耳粗多糖。 称取裙带菜 10g，粉碎，置于烧杯中加 20 倍体积的蒸馏水煎煮 1h，共煎煮三次，合并滤液，置于烧杯中，提取液置于烧杯中，浓缩至原体积的三分之一，将浓缩液加入三倍体积的无水乙醇醇沉 24h，减压抽滤，用无水乙醇洗涤，将沉淀于 60℃ 烘箱中干燥称重，得裙带菜粗多糖。 清 除羟基自由基（ •OH）活性分析方法 Fenton反应是经典的产生 •OH的体系，可认为能模拟人体内产生 •OH的过程，该反应是以双氧水为氧化剂，在亚铁盐作用下的氧化反应： Fe2+ + H2O2 → Fe 3+ + •OH + OH— 反应产生的羟基可以氧化番红使其褪色，利用分光光度法检测吸光度变化间接测定所产生的羟自由基。 在加入 H2O2前加入羟基自由基清除剂， Fenton 反应产生的羟自由基被清除或部分清除，体系在 520nm 波长处的吸光度降低程度相应减少，采用固定反应时间法，在 520nm 波长处测量 被测物反应液的吸光度并与空白液比较，从而测定被测物对 •OH的清除作用。 反应体系（ 1）中加入 PH=⒎ 4 的磷酸缓冲液 ⒉ 0ml，番红（ 520μg/ml） l ，EDTANaFe（ Ⅱ ）（ ∕L） ，再加入不同浓度的样品溶液 ， %的 H2O2 ，用蒸馏水定容至 10ml，混匀后于 37℃ 水浴中保温 30min，在 520nm波长处测吸光度 A 值。 反应体系（ 2）中加入 PH=⒎ 4 的磷酸缓冲液 ⒉ 0ml，番红（ 520μg/ml） l ， EDTANaFe（ Ⅱ ）（ ∕L） ，再加入不同浓度的样品溶液 ， %的 H2O2 ，用蒸馏水定容至 10ml，振荡摇匀后于37℃ 水浴中保温 30min，在 520nm 波长处测吸光度 A 值。 以上两体系测定时，每个试样做三次平行测定，取其平均值。 空白组以等体积的重蒸水代替样品溶液，对照组以等体积的重蒸水代替样品溶液和 EDTANaFe（ Ⅱ ）溶液，实验结果以清除率 E 表示： 100%  空白吸光度值对照组吸光度值 空白吸光度值样品组吸光度值E Ec50 表示清除率为 50%时的样品浓度 清除超氧阴离子自由基（ O2•—）活 性的分析方法 利用邻苯三酚自氧化反应，测定加入自由基清除剂对产生的 O2•—清除作用。 邻苯三酚在弱碱性（ TrisHClEDTA 缓冲液 PH=⒏ 2）环境中自氧化分解产生 O2•—的反应 邻苯三酚 O2•— + 其他产物 随着反应的进行， O2•—在体系中不断积累，致使反应液在 320nm， 325nm，440nm 波。