生物化学核酸章节考点总结(编辑修改稿)

生物化学核酸章节考点总结(编辑修改稿)内容摘要：

五、 变性、复性及杂交 变性、复性是核酸的重要的物化性质，相对蛋白质来说，核酸可以耐受反反复复的变性、复性。 这也是核酸研究技术的基础。 变性 （ 1）、 变性： 核酸双螺旋区的氢键断裂，变成单链，不涉及共价键断裂。 多核苷酸骨架上共价键的断裂称核酸的降解。 DNA 的变性是爆发式的，变性作用发生在一个很窄的温度范围内。 P350 图 518 变性过程 热变性 因素 酸碱变性（ pH 小于 4 或大于 11，碱基间氢键全部断裂） 变性剂（尿素、盐酸胍、甲醛） 260nm 吸收值升高。 变性后 粘度降低，浮力密度升高。 二级结构改变，部分失活。 （ 2）、 熔解温度（ Tm）或称熔点： DNA 的双螺旋结构失去一半时对应的温度。 DNA 的 Tm 一般在 70— 85℃之间。 浓度 50ug/mL 时，双链 DNA A260=，完全变性（单链） A260= 当 A260增加到最大增大值一半时，即 时，对应的温度即为 Tm。 （ 3）、 影响 DNA的 Tm 值的因素 ① DNA 均一性 均一性高，熔解过程发生在很小的温度范围 内。 ② GC 含量与 Tm 值成正比， GC 含量高，则 Tm 越高，测定 Tm，可推知 GC 含量。 GC%=（ ） P351 图 519 图 520 Tm 值与 GC 含量的关系 ③介质中离子强度 其它条件不变，离子强度高， Tm 高。 P351 图 521 复性 变性 DNA 在适当（一般低于 Tm20— 25℃）条件下，两条链重新缔合成双螺旋结构。 变性 DNA 在缓慢冷 却时（快速冷却可防止复性），可以复性。 DNA 片段越大，复性越慢； DNA 浓度越大，复性越快。 复性速度可用 Co t衡量。 Co 为变性 DNA 原始浓度 mol L1， t为时间，以秒表示。 P352 图 522，不同 DNA 的复性时间。 A． 1 个核苷酸对（ ） 图上查出 Cot1/2=4 若浓度为 Co= mol/L 则复性 50%所需时间 t= 秒 若要全部复性， Cot=104 t= 秒 B． 106碱基对 图上查出 Cot1/2=10 若浓度 Co= umol/L则复性 50%所需时间 t=107秒，约 115 天。 复性 100%Cot=500 t=5 108秒， 5758 天。 对于 ， 106bp，浓度达到 umol/L级时，浓度已很高。 复性机制： 1020bp 成、拉链 杂交（ DNA— DNA、 DNA— RNA） 将不同来源的 DNA 混合加热，变性后，慢慢冷却使它复性。 若这些异源 DNA 之间，在某些区域有相同的序列，则复性时会形成杂交分子。 第五节 核酸研究技术 一、 核酸的分离纯化 要求：尽可能保持其天然状态。 条件温和，防止过酸、过碱。 避免剧烈搅拌，抑制核酸酶。 DNA 分离纯化 真核 DNA 以核蛋白（ DNP）形式存在， DNP 溶于水或盐（ 1mol/L），但不溶于 ，利用此性质，可将 DNP 与 RNA 核蛋白分开，提取出 DNP。 DNA 核蛋白可用水饱和的酚抽提，去除蛋白质。 还可用氯仿异戊醇去除蛋白质。 RNA 的制备（重点介绍 mRNA 的分离、纯化） 用 ，上清中即为 RNA 核蛋白（ RNP）。 去蛋白：盐酸胍、苯酚等 必须防止 RNA 酶对 RNA 的破坏。 二、 核酸的凝胶电泳 琼脂糖电泳 ① 核酸分子的大小，迁移率与分子量的对数成反比 ② 凝胶浓度 ③ DNA 的构象，超螺旋最快，线形其次，环形最慢。 ④ 电流，不大于 5V/cm PAGE 电泳 三、 限制性核酸内切酶（ 1979年发现） 限制修饰系统 图 II 型核酸内切酶 核酸内切酶有 I、 II、 III 三种类型，其中 II 型酶在 DNA 克隆中十分有用。 II 型酶的特点：限制和修饰活性分开，蛋白质结构是单一成分，辅助因子 Mg2+，位点序列旋转对称（反向重复）。 II 型酶的切割频率 识别位点 4 44=256 6 46=4096 8 48=65536 Not I GCGGCCGC 限制酶的命名： 第一位： 属名 E（大写） 第二、三位： 种名的头两个字母小写 co 第四位： 菌株 R 第五位： 罗马字，从该细菌中分离出来的这一类酶的编号。 同裂酶：来源不同的限制酶（名称自然不同），识别同样的核苷酸靶序列，产生同样的切割，形成同样的末端。 BamH： GGATCC 同裂酶 BstI 识别位点相同，切割位点相同，产生同样的粘性末端。 同尾酶：来源各异，识别的靶序列不同，但都产生相同的粘性末端。 BamHI： GGATCC 同裂酶： BstI GGATCC 同尾酶： BclI TGATCA BglII AGATCT MboI GATC Sau3A GATC 星号活力：在一定条件下（低离子强度，碱性 pH，或 50%甘油），限制酶的特异性降低。 结果，它的识别与切割所需的典型的核苷酸序列的数量和种类会发生变化。 例如 HindIII AAGCTT 四、 DNA物理图谱及构建 （限制酶切图谱、 DNA 酶切位点图谱） 在研究某一种 DNA 时，弄清该 DNA 分子有哪些限制酶切位点是很重要的。 建立物理图谱是进一步分析此 DNA 的基础，末端标记法构建 DNA 物理图谱： （ 1）单酶完全降解和部分降解 （ 2）双酶降解 图 五、 分子杂交 Southern Blotting P353 图 523 DNA 样品 酶切 电泳 变性 转膜 固定 杂交 洗涤 放射自显影 变性（ NaOH ） 转膜（ NC 膜） 固定（ 80℃， 46h） 杂交（高盐浓度， 68℃，几小时） Southern Blotting 可用于 DNA 之间同源性分析，确定特异性 DNA 序列的大小和定位。 可用 DNA 或 RNA 探针。 Northern Blotting 研究对象是 mRNA 检测可与探针 DNA 同源杂交的 mRNA 分子的存在，因而可以研究细胞内特定 mRNA 的产生，即特定基因的表达。 mRNA 易形成局部二级结构，因此，总 RNA 或 mRNA 需在变性条件下电泳，乙二醛、甲醛可防止RNA 形成二级结构。 Western Blotting 是研究克隆基因表达产物、鉴定克隆株的常用技术。 六、 DNA序列分析 （一） 化学裂解法（ MaxamGilbert 法） DNA 一级结构测定原理： 利用特异性的化学裂解法，制备出具有同一标记末端，而另一端是长度只差一个核苷酸的片段群，然后将此片段群在能够分辨长度只差一个核苷酸 DNA 片段的 PAGE 上分离。 一定浓度的特测片段 32PGCTACGTA 特异性化学裂解 在 A 处 ： 32PGCT 和 32PGCTACGT 在 G 处： 32pGCTA 在 C 处： 32PG 和 32PGCTA 在 T 处： 32PGC 和 32PGCTACG 图 硫酸二甲酯特异切割： G 甲酸特异切割： G 和 A 肼在 Nacl 条件下切割： C 肼在无 Nacl 条件下切割： T 和 C 32P *ACTTCGACAA 硫酸二甲酯： *ACTTC 甲酸： *P *ACTTC *ACTTCG *ACTTCGAC *ACTTCGACA 肼（有 Nacl）： *A *ACTT *ACTTCGA 肼（无 Nacl）： *A *AC *ACT *ACTT *ACTTCGA 从下往上读： CTACGTA 末端 G 不能读出。 （二） 双脱氧终止法 英国 Sanger 1955 确定牛胰岛素结构 1958 获诺贝尔化学奖 1980 设计出 DNA 测序法 1980 再获诺贝尔化学奖 合成一段与待测 DNA 序 列互补的 DNA 片段群。 图 胰岛素的基因工程： A 链 63 个核苷酸 B 链 90 个核苷酸 （三） 序列分析仪 四色荧光基团标记的 ddNTP 七、 DNA合成（合成探针、引物、基因） 化学合成 —— DNA合成仪 DNA 固相合成（亚磷酸三酯法） 合成方向： 3’ 5’端 5’OH 用二对甲氧三苯甲基（ DMT）保护， 碱基上氨基用苯甲酸保护 3’OH 用氨基磷酸化合物活化 P353 合成过程 保护： 5’OH、活化 3’OH、 保护所有 NH2 DNA 的酶合成 —— PCR 用 DNA 聚合酶 I 必备条件： ①模板 DNA（单链） ②引物 ③ DNA 聚合酶 ④ dATP、 dGTP、 dCTP、 dTTP ⑤一定浓度的 Mg2+ 链合成方向： 5 ’ 3’端 新的 DNA 链合成，从引物 DNA 的 3’OH 开始。 图 链的增长反应是引物 DNA 的 3’OH，对脱氧核糖核苷三磷酸的α 磷原子亲核进攻的结果。 化学合成：方向 3’ 5’，不需 DNA 模板，不用酶。 生物合成：方向 5’ 3’，需模板，引物，用酶。 计划： 6 第七章 激 素。