发酵过程的生物学基础(编辑修改稿)

发酵过程的生物学基础(编辑修改稿)内容摘要：

类与酶的催化活力无关，估计主要是利于分泌至胞外。 同一类酶系中的不合糖类的酶组分，往往是结合在细胞膜上而很少分泌至胞外。 加入表面活性剂，则有可能因改变细胞膜的通透性而获得水解酶类的高产。 由于表面活性剂种类繁多，性质各异，尚未有规律可循。 如加入吐温 80 可增加里氏木霉纤维素酶产量，但对其它菌株就末得到同样效果。 8，筛选抗生素抗性突变株 抗生素种类繁多，其抑制微生物代谢的机制各不相同，一些主要抗生素的作用机制已比较清楚。 筛选抗生素抗性突变体，也能取得由此而改变代谢调节，获得过量生产的结果。 衣霉素可抑制细胞膜糖蛋白的生成。 枯草杆菌的衣霉素抗性突变株的 α— 淀粉酶的产量较亲株提高了 5 倍，研究结果表明，是由于分泌机制改变的结果。 抗利福平的蜡状芽抱杆菌的无芽孢突变株的 β— 淀粉酶 产量提高了 7 倍，这是由于芽孢形成的延迟利于 β— 淀粉酶的形成，而抗利福平的突变株往往失去了形成芽抱的能力。 谷氨酸捧杆菌的抗青霉素突变株的谷氨酸产量亦会增加。 对金属离子的抗性和对有丝分裂的抑制剂抗性的突变株，也被用于改变细胞代谢调节以 得到代谢产物的高产。 9，选育条件抗性突变株 因环境不同，能表现为“野生型”菌株的特性和突变型菌株特性的突变被称为条件抗性 突变或称为条件致死突变。 其中温度敏感型突变常被用于提高代谢产物的产量。 适于在中温条件下 (如 37℃ 左右 )生长的细菌，经诱 变后可得到在较低温度下生长而在较高温度 (如 37℃ 以上 )不能生长的突变株，即温度敏感型突变株。 这是由于某一酶蛋白结构改变后，在高温条件下活力丧失的缘故。 如此酶为蛋白质、核苷合成途径上的酶，则此突变株在高温条件下的表型就是营养缺陷型。 诱变处理乳糖发酵短杆菌，得到的温度敏感突变株，在 30℃ 生长良好，在 32℃ 生长微弱，但能在富含生物素的培养基中积累谷氨酸，而野生型菌株却受生物素的反馈抑制。 在富含生物素的天然培养基中进行发酵时，可先在正常温度下进行培养以得到大量菌体，适当时间后提高温度，就能获得谷氨酸的过量生产。 经多 次诱变后得到的高产菌株，往往是孢子形成能力减弱或丧失，这给保种传代都带来困难。 筛选在低温下能形成芽孢的温度敏感突变株，就能解决此困难。 10，调节生长速率 在酶的诱导合成研究中发现，一些物质具有诱导效应及难被利用；与其只能维持较低的生长速率有关。 而起阻遏作用的物质则部是易被迅速利用和能维持高的生长速率。 估计这是因为诱导、阻遏的发生都与产能代谢有关而造成的。 因此，改变培养条件如温度、供氧量等以控制生长速率，也能获得一定效果。 里氏木霉纤维素酶的大量合成是在菌体大量形成时，如控制它的比生长速率近于零 ，则能在一较长时间内持续合成纤维素酶并获得高产。 11， 加入酶的竞争性抑制剂 生物化学上把底物和抑制剂与酶相结合时呈现的互相排斥现象称为竞争性抑制，即酶与抑制剂结合后就不能与底物相结合，反之亦然。 葡萄糖经不完全氧化 (酵解 )生成丙酮酸，脱羧生成乙酰辅酶 A，进入三羧酸循环。 乙酰辅酶 A 与草酰乙酸经柠檬酸合成酶催化，把乙酰基由乙酰辅酶 A 转移至草酰乙酸而成为柠檬酸。 柠檬酸又因乌头酸酶的存在而和它的异构体顺乌头酸、异柠檬酸呈平衡。 单氟乙酸在微生物细胞内可转变为单氟柠檬酸，此酸与乌头酸酶有竞争性抑制， 因此，向培养基中加入单氟乙酸可导致柠檬酸的积累，减少异柠檬酸的生成。 由此，筛选不能利用柠檬酸或对单氟 乙酸敏感的突变袜，都达到了提高柠檬酸产量和减少异柠檬酸生成的结果。 这些突变株的乌头酸酶的活力都比较低。 二、提高次级代谢产物产量的方法 次级代谢产物是指细胞生长不必需的、无明显生理功能的微生物代谢产物。 其结构往往比较复杂，虽对产生菌的生长不是必需的，但在自然环境中对产生菌的存活还是有益的。 从分子结构上看，次级代谢产物可分为糖苷类、多肽类、酰基类、核苷类及混杂类。 它们均来自初级代谢产物，为其直接衍生物，或者 经分子结构上的修饰，或进一步装配、聚合而成。 其合成过程远较初级代谢产物复杂。 初级代谢产物的形成一般只需简单的营养条件，在化学成分确定的培养基中即可生成。 而次级代谢产物则需要复杂的营养条件，往往需要供给营养成分复杂的天然物质时才能形成。 在各种条件下，初级代谢产物都能形成，而次级产物则往往仅在一特定培养条件下才能形成，尤其过量生产。 在分批培养条件下，次级代谢产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。 在发酵过程中如何使次级代谢产物进入分化期，即次级代谢产物形成的诱导或引发，是发酵工艺研究中的热门之一。 生理学 上的研究表明，在菌体生长峰值过后，培养基中可利用的 C、 N、 P、 S等主要元素已基本耗完，与这些原料的利用有关的酶活力趋于下降，与次级代谢产物形成有关的酶类逐渐出现。 但是，菌体生长与产物合成两个时期的划分及相应的这些生理特性的变化还取决于培养条件。 ’ 目前，次级代谢产物的生产都还是沿用分批发酵方法，抗生素类的产物在此条件下又多为在菌体生长速率下降后才积累，但又难以长期持续合成。 因此，通过控制培养条件以尽量 维持次级代谢产物的合成期，亦是获得过量生产的重要途径。 常用的提高次级代谢产物产量的方法有以下几种： 1，补加前体类似物 在合成途径已基本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。 如青霉素 G 的生产中，苯乙酰 — CoA 是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素 G 的产量。 青霉素分子是 6APA 环形成后，再形成不同侧链。 加入不同的前体就可以得到不同种类的青霉索，补加苯氧乙酸即得到青霉素 V。 多肽类和放线菌素类抗生索的合成中，也都能通过加入不同前体而得到不同种类的抗生素。 这也可以称之为定向合成。 加入硝酸盐可提高利福霉索的产量，其原因在于它抑制了脂肪酸的合成，使合成脂肪的前体丙二 酰 CoA 转为利福霉素分子的脂肪环提供前体。 次级代谢产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。 加入前体提高产量的效果更取决于总体代谢的调节水平。 前体物质本身是否易于得到等。 这部是在生产应用中需综合考虑的。 2，加入诱导物 把一些对次级代谢产物产生有诱导作用的物质加入发酵培养基中会增加产量，如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素 C，加入巴比妥可提高利福霉素产量等。 但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。 3，防止碳分解代谢阻退或抑制的发生 青 霉索发酵中限量流加葡萄糖 (或糖蜜 )以减少碳分解阻遏的发生，早已是一项很有效的提高产量的方法。 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解阻遏的发生。 加入影响糖代谢的硫氰酸苄酯可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。 4，防止氮代谢阻遏的发生 避免使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代谢阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比较成熟的经验。 在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。 使用亚适量 (对菌体生长 )的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。 为防止碳、氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 5，筛选耐前体或前体类似物的突变抹 加入前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。 筛选对前体育抗性的突变株以减少或消除前体的反馈阻遏，从而可获得高产；如抗苯乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。 半胱氨酸、缬氨酸是 内酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的类似物，三氟亮氨酸、DL缬氨酸的抗性菌株，其 β内酰胺类抗生索产量会提高。 6，选育抗抗生素突变株 链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。 一株高产抗生索产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生索的抗性。 筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。 金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果已有不少报道。 7，筛选营养缺陷型的回复突变株 次级代谢产物都来自初级代谢产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低，但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不 清楚，估计是次生产物或其前体合成的反馈抑制被解除。 在金霉素产生菌选育中，运用此方法曾获得高产菌株。 8，抗毒性突变株的选育 重金属离子、羟胺类物质对 β 内酰胺类抗生素产生菌有毒，但与抗生素相结合可解毒。 选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗生素类物质过量产生的突变株。 曾由头孢霉素 C 对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。 以上主要是从微生物的代谢调节机制出发探讨获得代谢产物过量生产的方法。 但是，微生物代谢产物特别是次级产物形成的途径和调节控 制机制是相当复杂的，研究得比较清楚的只是少数。 因此，上述方法的应用往往也是经验性的。 在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。 近年来运用遗传工程的方法以获得代谢产物的过量生产是很活跃的研究领域。 三、高浓度微生物的培养 1，为什么要采用高浓度微生物的培养。 微生物液体发酵大都采用分批培养，这种培养方式的缺点是：发酵液中最终细胞浓度不高。 如果通过改进工艺技术，使发酵液中微生物细胞增殖很高的浓度，那么，高浓度的细胞将会产生高浓度的发酵产物，这样就可以大 大提高发酵设备的利用率，降低生产成本。 基于这种目的，人们开始研究微生物高细胞浓度的培养技术。 采用高细胞浓度培养技术，发酵液中菌体浓度比分批式培养可高 10 倍以上。 例如用高细胞浓度连续培养技术，培养大肠杆菌HBl01(pPAKS2)，可得到 95g／ L 的菌体。 用同样的方法培养酒精酵母可得到 219g／ L 的菌体。 而一般用分批法培养酵母和细菌，得到的菌体浓度仅为 10g／ L 左右。 2，高细胞浓度培养技术的原理： 采用一定的工艺技术，保证微生物生长的适宜条件，延长微生物的指数增殖过程，从而得到高浓度的细胞。 3，高细胞浓度 培养技术的优点 （ 1）可大大提高发酵设备的利用率 （ 2）节省能源 4，高浓度细胞培养的方法 （ 1）流加培养 要保持微生物生长的适宜环境条件以达到高菌体浓度，就必须采用恰当的流加补料方式，补充生长所需的所有营养物。 因渗透压的影响，在分批式培养中，不能靠过高地提高培养基浓度来获取高浓度的细胞采用流加技术，可不断地满足菌体生长繁殖的需要，最终可以获得高浓度的细胞。 采用流加培养技术，还可以实现对发酵过程的控制，如控制代谢途径、菌体比生长速率等。 这类技术还有一大优点是，无需增添设备，只需改进工艺就可以在生产上 广泛应用。 流加培养技术还可解决以下问题： 底物抑制 ：在许多发酵过程中，某些底物如乙醇和苯环类化合物，只有在低浓度情况下，才不抑制菌体的生长。 在分批培养中，若提高这些底物的浓度，就会出现底物对生长的抑制。 而在发酵过程中流加这类底物，控制它们在发酵液中的浓度，使之一方面能不断满足菌体生长的需要，另一方面又不会抑制菌体的生长，这样，底物抑制就能被消除。 分解代谢阻遏 ：如果微生物利用葡萄糖等易于代谢的碳源，代谢产生的物质会使细胞内的环腺苷酸浓度降低，造成某些酶终止合成，这种现象称分解代谢阻遏。 在流加培养过程中，缓慢 流加这种碳源，可消除分解代谢阻遏作用。 葡萄糖效应 ：培养面包酵母时，存在一临界葡萄糖浓度，培养基中葡萄糖高于此浓度时，会部分代谢成乙醇，甚至在有充足溶解氧的条件下也会产生乙酵，此现象称葡萄糖效应。 采用流加技术，可以控制葡萄糖浓度在此临界浓度以下，这样就可以防止乙醇产生，得到高浓度的面包酵母。 为了实现需氧微生物的高浓度培养，需要一个能供给大量氧气的高性能发酵罐。 溶解氧浓度 [DO]需要保持在每升几个微克以上，但也不能过高。 大体上应该保持在 109g／ L 以下。 不过，需氧微生物培养中，最容易缺乏的营养物仍然是 [DO]。 完全可以说 [DO]是高菌体浓度培养生长速率的控制因素。 碳源是最重要的营养物，要用恰当的方式自动流加。 氮源可结合 pH控制与碳源一起流加，并利用氨气传感器或铵离子选择电极等实行自动流加控制。 微生物生长至少需要十几种无机离子，很难对这么多离子的浓度进行连续检测，因而无法对其浓度进行反馈控制，可以与碳源或氮源同时自动流加。 加料流量根据物料衡算确定，所有营养物都可通过计算机控制自动流加。 流加培养的控制方式 无反馈控制  恒速流加  变速流加  指数流加 反馈控制  DO恒定控制 pH恒定控制 CO2 生成速率控制 细胞浓度控制 底物浓度控制 （ 2）高细胞浓度连续培养 原理： 无菌培养基以一定速度连续补入发酵液，同时采用离心。 膜过滤等方法，回收排出液中的细胞，使之重新进入发酵液中，这样微生物就可以在发酵液中高浓度地积累。 高浓度的细胞产生大量的发酵产物，这些产物随排出液排出进入提取过程，同时对细胞生长起抑制作用的代谢产物也被排出。 除去抑制物质的方法： 透析培养：通过半透膜使培养液与培养基接触，培养液中的。