pcr污染与对策(编辑修改稿)

pcr污染与对策(编辑修改稿)内容摘要：

，至少 PCR 操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用，尤其是 PCR 产物分析所用加样器不能拿到其它两个区； 8. 重复实验，验证结果，慎下结论。 二． 追踪污染源 如果不慎发生污染情况，应从下面几条出发，逐一分析，排除污染。 （一）设立阴阳性对照：有利于监测反应体系各成分的污染情况。 选择阳性对照时，应选择扩增弱，且重复性好的样品，因强阳性对照可产生大量不必要的扩增序列，反而可能成为潜在的污染源。 如果以含靶序列的重组质粒为对照， 100 个拷贝之内的靶序列就足以产生阳性扩增。 阴性对照的选择亦要慎重， 因为 PCR 敏感性极高，可以从其它方法（ Sourthern 印迹或点杂交等）检测阴性的标本中检测出极微量的靶分子。 此外，每次扩增均应包括 PCR 体系中各试剂的时机对照，即包括 PCR 反应所需的全部成分，而不加模板DNA，这对监测试剂中 PCR 产物残留污染是非常有益的。 如果扩增结果中试剂对照为阳性结果，就是某一种或数种试剂被污染了。 此时，要全部更换一批新的试剂进行扩增，扩增时设立不同的反应管，每一管含有一种被检测试剂，在检出污染试剂后，应马上处理。 （二）环境污染：在排除试剂污染的可能性外，更换试剂后，若不久又发现 试剂被污染了，如果预防措施比较严密，则考虑可能为环境污染。 环境污染中常见的污染源主要有： 1. 模板提取时真空抽干装置； 2. 凝胶电泳加样器； 3. 电泳装置； 4. 紫外分析仪； 5. 切胶用刀或手术刀片； 6. 离心机； 7. 冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等； 此时可用擦拭实验来查找可疑污染源。 1）用无菌水浸泡过的灭菌棉签擦拭可疑污染源； 2） 去离子水浸泡； 3）取 5ml 做 PCR 实验； 4）电泳检测结果。 8. 气溶胶。 如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中 PCR 产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物（与原引物无相关性）。 三．污染处理 （一）环境污染 1. 稀酸处理法：对可疑器具用 1mol/L 盐酸擦拭或浸泡，使残余 DNA脱嘌呤； 2. 紫外照射（ UV）法：紫外波长（ nm）一般选择 254/300nm，照射 30min 即可。 需要注意的是，选择 UV作为消除残留 PCR 产物污染时，要考虑 PCR 产物的长度与产物序列中碱基的分布， UV 照射仅对 500bp 以上长片段有效，对短片段效果不大。 UV 照射时， PCR 产物中嘧啶碱基会形成二聚体，这些 二聚体可使延伸终。