pcr常见问题总汇(编辑修改稿)

pcr常见问题总汇(编辑修改稿)内容摘要：

铺板 DNA的总量是转化反应所用的量除以稀释倍数。 具体而言转化用 10ng DNA，用 SOC 稀释到 1000u后含 10 ng DNA，用 1/10 铺板，共用 1 ng DNA。 转化率为： 1000 克隆 X10（ 3 次方） ng /铺板 1 ng DNA ug=10（ 6 次方） cfu/ ug 转化 pGEMT 应用 10（ 8 次方） cfu/ ug 感受态细胞 如没有菌落或少有菌落，感受态细胞的转化率太低。 C）如用 pGEMT 正对照，或 PCR 产物，产生 2040 蓝斑（用指定步骤 10（ 8 次方） cfu/ ug 感受态细胞），表明载体失去 T。 可能是连接酶污染了核酸酶。 T4 DNA连接酶（ M1801， M1804， M1794）质量标准好无核酸酶污染，不应用其它来源的 T4 DNA连接酶替换。 D）用 pGEMT 或 pGEMT Easy 载体，连接 pGEMT 正对照，转化高频率感受态细胞（ 10（ 8 次方） cfu/ug） ,按照指定的实验步骤，可得 100 个菌落，其中 60%应为白斑，如产生 2040 蓝斑 , 没有菌落或少有菌落，连接有问题。 4)对照实验结果好，却没有回收到目的片段，实验出了什么问题。 A）连接用室温保温 1 小时，能满足大多数克隆，为提高效率，需 4℃ 过夜。 B）插入片段带有污染，使 3`T 缺失，或抑制连接，抑制转化。 为此，将插入片段和 pGEMT 正对照混合，再连接。 如降低了对照的菌落数，插入片段需纯化，或重新制备。 如产生大量的蓝斑，插入片段污染有核酸 酶，使 pGEMT 或 pGEMT Easy 载体 3`T 缺失。 C）插入片段不适于连接。 用凝胶纯化的插入片段，因受 UV 过度照射，时有发生。 UV过度照射会产生嘧啶二聚体，不利于连接， DNA必需重新纯化。 D）带有修复功能的耐热 DNA聚合酶的扩增产物末端无 A，后者是 pGEMT 或 pGEMT Easy 载体克隆所需。 加 Taq DNA聚合酶和核苷酸可在末端加 A。 详情查 pGEMT pGEMT Easy 载体技术资料（ TM042）。 E）高度重复序列可能会不稳定，在扩增中产生缺失和重排，如发现插入片段高频率地产生缺失和 重排，需用重组缺陷大肠杆菌菌株，如 SURE 细胞 PCR 反应体系与反应条件 标准的 PCR 反应体系： 10扩增缓冲液 10ul 4 种 dNTP 混合物 各 200umol/L 引物 各 10～ 100pmol 模板 DNA ～ 2ug Taq DNA聚合酶 Mg2+ 加双或三蒸水至 100ul PCR 反应五要素： 参加 PCR 反应 的物质主要有五种即引物、酶、 dNTP、模板和 Mg2+ 引物： 引物是 PCR 特异性反应的关键， PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA互补的程度。 理论上，只要知道任何一段。