辣木黄酮和多糖提取方法及其含量影响因素的初步研究毕业论文(编辑修改稿)

辣木黄酮和多糖提取方法及其含量影响因素的初步研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

，直至上清液中无明显的蛋白质出现为止。 将透明的上清液定容至 250ml，获得多糖待测液，用于测定吸光度值。 测完吸光值后的剩余待测液 → H2O2 脱色 (用氨水调 pH 为 左右，加 倍于多糖液体积的 H2O2， 40℃ 水浴保温 4h 脱色。 ) → 606512 旋转蒸发浓缩 → 加入 4 倍体积的无水乙醇 4℃沉淀过夜 → 离心 (8000rpm， 10min) → 沉淀物用 80%乙醇、丙醇、石油醚依次洗涤 → 室温真空干燥得多糖粗品。 葡萄糖标准曲线的绘制 准确称取葡萄糖标准品 21mg，蒸馏水溶解后，定容至 100 ml，得到 ／ ml的葡萄糖母液。 准确吸取此溶液 5ml，分别置于 10ml 具塞 试管中，并用蒸馏水定容，准确吸取各浓度溶液 2m1 分别置于 10ml 具塞试管中，每管加入 5％苯酚溶液 (取苯酚 100g，加铝片 和 NaHCO,，蒸馏收集 182℃ 馏分。 称取 ，加水 150ml 溶解，置棕色瓶内放冰箱内备用 )。 再垂直快速加入浓硫酸 ，井用蒸馏水定容至刻 度，摇匀，放置 5min，沸水加热 ，用分光光度计于 490nm 处测定吸光值，同时以试剂空白作参比。 以最小二乘法作线形回归方程，得葡萄糖质量浓度 c(mg／ ml)与吸光度月的关系为 ： A=+ ， R2=。 在／ ml 范围内，吸光度与浓度线形关系良好。 辣木多糖的测定 准确吸取多糖待测液 于 10ml 容量瓶中，定容，作供试液；精密吸取供试液 ，按标准曲线的制各项下自加入“苯酚试剂 ”起 ， 于 490nm 处测定吸收度。 从回归方程求出供试液中葡 萄糖含 量，按下 式计算 多糖含 量 ： 多 糖含量W%=，其中 c 为供试液的葡萄糖浓度 (mg／ m1)， D 为供试液的稀释因素， f 为换算因素， m 为供试品重量 (mg)。 多糖换算因子的测定 精密称取上述制得的试样多糖租品 于 100ml容量瓶中，用蒸馏水定容。 取按标准曲线方法操作，根据回归方程计算多糖中葡萄糖的浓度，按下式计算出换算因子 f， f=W／ C*D，其中 w 为多糖质量 (mg)， C 为葡萄糖浓度 (mg／ m1)， D 为稀释因素。 葡萄糖标准品稳定性试验 取供试液，每隔一定时间测定吸光度值，观察其结果在显色一定时间内吸光度值有无变化。 2 3 辣木多糖提取条件设计 蒸馏水为提取溶剂，分别研究不同溶剂用量 (10 倍、 15 倍、 20 倍、 25 倍、 30 倍 )： 不周提取温度 (60℃ 、 70℃ 、 80℃、 90℃、100℃ )；不同提取时间 (60min、 90min、 120min、 150min、 180min)；不同提取次数 (1 次、 2 次、 3 次、 4 次、 5 次 )等单因素对辣木中多糖量的影响。 考虑到上述各因素 之间 的互作效应，在单因素试验的基础上 .采用四因素三水平 L9(34)进行正交试验，以确定最佳提取条件组合 .正交试验因素水平见表 1。 表 2 多糖正交实验因素水平表 水平 A B C D 提取温度 /℃ 溶剂用量 /倍 提取时间 /min 提取次数 1 80 15 90 1 2 90 20 120 2 3 100 25 150 3 3 结果与分析 辣木总黄酮影响因素的试验与分析 提取方法与提取条件对辣木叶总黄酮量的影响 不同提取方法的比较 表 3 多糖正交实验因素水平表 提取方法 黄酮总量 /% 显著性 1 2 3 平均值 标准差 回流法 a A 水提法 a A 超声法 b B 离心法 c C 分级法 c C 采用水提取、有机溶剂回流提取、有机溶剂离心提取、超声波提取和分级沉淀提取等五种方法对辣木叶粉中总黄酮进行了提取，提取效果如表 3 所示。 五种方法都能从辣木中提出黄酮。 但在不同的提取方法下辣木叶总黄酮量不同，范围在 ％～ ％之间，总黄酮量较高的是回流法和水提法，超声法次之，总黄 酮量量较低的是离心法和分级沉淀法。 其中回流法和水提法差异不显著，但显著高于其他三种方法 .离心法和分级沉淀法差异不显著。 芦丁标准曲线制作及稳定性试验 本研究以最小二乘法作线形回归方程，得芦丁质量浓度C(mg／ m1)与吸光度 A 的关系为 ： A=，相关系数r= mg／ ml 范围内。 吸 光度与浓度线形关系良好 . 准确吸取芦丁标准溶液 ，分置于 10ml 容量瓶中，各加乙醇至 5ml； 余下步骤按 芦丁标准曲线的制作方法操 作，测定结果见图 l。 试验表明，在室 温 ≤ 25℃的环境中，显色时问在 15～ 70min 范围内，吸光度没有变化。 80min 以后开始下降。 因此，在本试验选择的测定时 间 内，黄酮类化合物与铝离子生成的络合物显色是稳定的。 图 1 芦丁标准品稳定性 不同提取溶剂对辣木叶总黄酮量的影响 表 4 不同溶剂回流的辣木叶总黄酮量 溶剂 黄酮总量 /% 显著性 1 2 3 平均值 标准差 乙醇 a A 甲醇 a A 丙酮 b B 根据 方法的比较。 回流法提取的辣木叶总黄酮量最高，在此基础上其他条件一致，选用三种不同的溶剂对辣木叶干粉中黄酮进行了回流提取，结果如表 4。 从表中可以看出。 回流法的提取溶剂以乙醇最好，甲醇次之，丙酮最差。 差异性分析表明用乙醇做溶剂和用丙酮傲溶剂有显著性差异 .而乙醇溶剂和甲醇溶剂之间则没有显著性差异。 但从经济、安全方面考虑，用乙醇作溶剂更为实用。 综合以上结果可知。 用水 提法、甲醇回流法和乙醇回流法均对辣木总黄酮具有较高的提取率。 从经济、安全、实用方面考虑，乙醇回流法是最适合辣木总黄酮的提取方法。 乙醇浓度对辣木叶总黄酮量的影响 其他条件相同的时候，分别以不同浓度的乙醇溶液回流提取黄酮。 从图 2 可以看出 ： 乙醇浓度在 60%～ 80%的范围内辣木叶总黄酮量较高，其中以 70％的乙醇提取效果最好，总黄酮量可达到 ％；乙醇浓度高于 80％提取效果显著降低，从 ％下降到 ％。 这是由于乙醇浓度过高，使黄酮类化合物的溶解度下降，而脂溶性物质的溶出量增加，从而导致黄 酮类化舍物的浸出率下降。 图 2 不同乙醇浓度下提取的辣木叶总黄酮量 条件 ： 5g， 70℃，乙醇用量 20 倍，回流 3 次，每次 120min 乙醇用量对辣木叶总黄酮量的影响 如图 3 所示，随乙醇用量的增加，辣木叶总黄酮量呈梯度变化。 其中乙醇用量由 10 倍上升到 20 倍时，黄酮类物质浸出率上升比较快，由 ％上升到 ％ .总黄酮量达到最大；乙醇用量在 20 倍以后。 辣木叶总黄酮有所下降，但在乙醇用量为 25 倍时。 总黄酮量变化不明显。 乙醇用量越大，浓度梯度越大，物质溶出越多，但是当达到平街后再增大溶 剂量 .浸出物的变化就不明显了，所以 20 倍的乙醇用量是一个平衡点。 图 4 不同条件下提取的辣木叶总黄酮量 条件 ： 5g， 70%乙醇 20 倍，回流 3 次，每次 120min 提取时间对辣木叶总黄酮量的影响 其它条件一定时，考察提取时间对提取效果的影响。 从图 5可以看出 ： 随着提取时间的增加 .辣木叶总黄酮量增加，提取时间达到 120min 时，总黄酮量达到最大，当提取时间继续 加长 时，对总黄酮量的影响不大，表明提取时间达到 120min 时，有效成分已基本溶出。 图 5 不同提取时间下提取的辣木叶总黄酮量 条件 ： 5g， 70℃ ， 70%乙醇 20 倍，回流 3 次 提取次数对辣木叶总黄酮量的影响 如图 6 所示，其他条件一致的情况下 .随提取次数的增加，辣木叶总黄酮量呈上升的趋势。 当提取次数到 4 次时，总黄酮量变化不大，说明提取 4 次以后，有效成分已基本溶出。 图 6 不同提取次数下提取的辣木总黄酮量 条件 ： 5g， 70℃ ,70%乙醇 20 倍，每次 120min 多因素正交试验下的辣木叶总黄酮量 对试验结果进行直观分析 (表 5)和方差分析 (表 6)，可以看出，辣木乙醇回流提取时。 各个因素对辣木叶总黄酮提取效果影响程度不同，各因素的影响程度依次为提取次数 (D)提取温度 (A)乙醇用量 (B)提取时间 (C)。 由方差分析结果可知，其中提取次数影响程度最大 .提取时间影响程度最小，但均未达到显著水平。 各因素的最佳组合水平为 A3B2C1D3， 即辣木总黄酮的最佳提取条件为 ： 用 70%的乙醇作为提取溶荆， 提取温度 80℃ ，乙醇用量 20 倍，提取时 间 90min，提取次数 3次。 在此提取条件下。 辣木总黄酮量可达 ％。 陈瑞娇对辣木叶总黄酮提取效果的研究结果认为，提取条件的影响程度为提取 次数 提取温度 乙醇用量 提取时间，与本文研究结果完全一致。 但最佳提取条件为 ： 用 70%的乙醇作为提取溶剂，提取温度 20 倍。 提取时间 60min， 提取次数 3 次 ， 在此提取条件下 ， 辣木总黄酮量为 ％。 其测定结果与本研究有较大差异。 原因可能与测定方法、辣木产地、辣木采集时间、采集部位等因素有关。 表 5 辣木叶总黄酮提取条件的正交实验结果 试验号 总黄酮量 /% A B C D 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 K1 K2 K3 X1 X2 X3 R 表 6 不同提取条件下辣木叶总黄酮量的方差分析 误差来源 离差平方和 自由度 方差 方差比 F 临界值 Ss f s F A 2 = B 2 = C 2 = D 2 误差 8 生长发育对辣木总黄酮含量的影响 不同叶龄叶片 的辣木总黄酮含量 表 7 的结果表明 ： 随着叶龄的增长，辣木叶片的总黄酮含量呈不规律变化，当叶龄增长到 45d 时，叶片的总黄酮含量达最高，为 ％；其次为生长 15d 的幼龄叶和 60d 的老龄叶，总黄酮含量为 ％ ~％之间；生长 30d 的壮龄叶的总黄酮含量最低，只有 ％。 45d 叶的总黄酮含量与 15d 叶差异不显著。 显著大于 30d 和 60d 叶龄叶的总黄酮含量。 表 7 不同叶龄叶片辣木的总黄酮量含量变化（ n=9） 叶龄 /d 总黄酮含量 /% 15 177。 ab AB 30 177。 b B 45 177。 a A 60 177。 b B 注 ： 表中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（ P,P,多重比较采用 Duncan） 以上结果表明，辣木叶片中的黄酮在幼嫩的叶中就有较高的含量，随着叶片的快速扩展，在叶片的壮龄期略有降低，可能是由于叶片的生长速度快于黄酮的合成速度；当叶面积的扩展变缓时，黄酮的积累量达到了最高值；随着叶片的老化，黄酮含量出 现了下降趋势。 因此。 以提取黄酮食用新鲜蔬菜等为目的辣木叶片的采收应以叶龄 45d 左右的叶为最佳。 不同器官的辣木总黄酮含量 由表 8 可以看出 ： 辣木全株均含有黄酮 .但是不同器官的总黄酮含量差异非常显著，器官间总黄酮含量依次为 ： 花柄 叶 花 叶柄 茎 果 果荚 种子 根，其中花柄中的总黄酮含量最高，可达 ％；其次为叶片，含量为 ％；根中的黄酮含量最少，只有 ％。 差异显著性分析表明，除果与果荚、种子与根之间差异不显著外，其他器官问差异均达到了极显著水平。 表 8 不同 器官辣木总黄酮含量的变化 （ n=3） 器官 总黄酮含量 /% 叶 177。 b B 叶柄 177。 d D 茎 177。 e E 花 177。 c C 花柄 177。 a A 果 177。 f F 果荚 177。 f F 根 177。 g G 种子 177。 g G 注 ： 表中相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（ P,P,多重比较采用 Duncan） 生长环境对辣木总黄酮含量的影响 不同采收期对辣木总黄酮含量的影响 从 7 到 11 月，每月采收一次辣木的叶、叶柄和茎，比较同一器官、不同采收期的辣木总黄酮含量。 从表 10 中可以看出 ，不同器官辣木的总黄酮含量随采收时期的变化规律是一致的。 各器官的总黄酮含量都以在儿月采收时为最高，分别为叶 ％、叶柄 %、茎 ％；以 9 月采收时为最低。 其中 11 月采收的辣木叶总黄酮含量与其他 4 个月采收的差异极显著 ： 10月采收的辣木叶总黄酮含量间差异不显著；它们都显著高于 9 月采收的辣木叶总黄酮含量。 11 月采收的辣木叶柄总黄酮含量显著大于其他几个月，除了 8 月与 9 月之间差异显著外，其他 各月 之问差异均不显著。 11 月采收的辣木茎总黄酮含量与 8 月采收的辣木叶柄总黄酮含量差异不显著，但显著大于 10 月采收的辣木叶总黄。