高产γ-氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育毕业论文(编辑修改稿)

高产γ-氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

电炉 丹阳市飞和五金电器厂 可见分光光度计 722 上海佑科仪器仪表有限公司 磁力搅拌器 SK1 金坛市杰瑞尔电器有限公司 美的电冰箱 BCD— 195TC 合肥荣氏达冰箱有限公司 高通量恒温振荡器 Canvic HTST008 上海世平实验设备有限公司 不锈钢蒸馏水器 上海生银医疗仪器仪表有限公司 本试验还需用品： Eppendorf 离心管、烧杯、玻璃棒、镊子、试剂瓶、量筒、洗瓶、石棉网、锥形瓶、培养皿、剪刀、白铁锅、酒精灯、试管架、冰袋、试剂勺、涂布棒、甘油管等。 培养基及相关试剂的配制 （ 1） MRS 液体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 柠檬酸三胺 硫酸镁 硫酸锰 吐温 80 ℃ 灭菌 25 分钟 （ 2） MRS 固体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 柠檬酸三胺 硫酸镁 硫酸锰 琼脂 20～ 25g 水 1000mL 115℃ 灭菌 25 分钟 （ 3）含 GABA 的 MRS 固体培养基：鱼粉蛋白胨 10g 酵母提取物 10g 葡叶杨：高产 γ 氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育 萄糖 5g 乙酸钠 5g 磷酸氢二钾 柠檬酸三胺 硫酸镁 硫酸锰 琼脂 20～ 25g GABA 60g 水 1000mL 115℃ 灭菌 25 分钟 （ 4）发酵培养基：酵母提取物 5g 胰蛋 白胨 5g 葡萄糖 10g 丁二酸钠5g 1%的谷氨酸钠 水 1000mL 115℃ 灭菌 25分钟 （ 5）生理盐水溶液： 溶于 200mL 蒸馏水。 115℃ 灭菌 25min。 （ 6）硼酸缓冲液 硼砂和 硼酸溶解后定容至 100mL。 (3)谷氨酸钠溶液： 的谷氨酸钠加入 100mL 的无菌水中，配制用于对照的谷氨酸钠溶液。 安徽工程大学毕业论文 徽工程大学毕业 设计（论文） 第 3 章 实验方法 对乳酸菌 HX36进行 ARTP 诱变育种 乳酸菌 HX36生长曲线的测定 （ 1）菌种的活化：将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按 10%（ v/v）接种量接种 1mL 乳酸菌于装有 9mL 的 MRS 液体种子培养基的 50mL 三角瓶中，静置于 30℃ 培养箱中培养 24h 待用。 （ 2 ）乳酸菌生长曲线绘制：取出上述活化后的菌悬液，按 10%（ v/v）接种量接种接种 1mL 菌悬液到装有 9mL MRS 液体培养基的 50mL 三角瓶，置于 30℃培养箱中培养，每隔 3h 用分光光度计在 600nm 条件下测得菌液 OD 值，并 以时间为横坐标， OD值为纵坐标绘制乳酸菌的生长曲线。 同时用 pH 计对乳酸菌菌悬液的 pH 值进行测定。 ARTP 诱变 （ 1） 菌悬液的制备：将标准储备菌株取出，并恢复至室温后，按 10%（ v/v）接种量接种 1mL 乳酸菌于装有 9mlL 的 MRS 液体种子培养基的 50mL 三角瓶中，静置于 30℃ 培养箱中培养待用，取 1mL 待用菌液于 的离心管中，5000r/min 离心 5 分钟，离心后去除上清液加入 1mL 的无菌水使用振荡器震动摇匀，制成菌悬液备用。 （ 2） ARTP 诱变操作： 在无菌操作台上 使用 20μL 移液 枪吸取上述制备好的菌悬液 10μL 到灭菌的小铁片上（共做 8组）， 8组菌液用 ARTP 进行诱变处理的时间分别为 0s、 30s、 60s、 90s、 120s、 150s、 180s、 210s、 240s。 叶杨：高产 γ 氨基丁酸乳酸菌的等离子诱变选育 常压室温（ ARTP ） 等离子诱变育种装置，在本实验中使用条件如下所述；供电电源： 220V， 50Hz，电压波动范围 ≤ 5% ，气体流量选用 10SLM，温度20～ 40℃ 以下，功率 200W。 用镊子将待处理样品载片放置到旋转定位台上方菌片固定圆形凹槽内，之后调节旋转定位台高度，使待处理样品距离等离子体发生器出口为 3 mm，样品放置完毕后，关闭操作室门，选择照射时间。 后培养及平板计数 （ 1）后培养：将诱变后的载有菌液的小铁片迅速放入装有 MRS 液体培养基的离心管中，然后将诱变的乳酸菌放入恒温培养箱中 30℃ 培养 2h。 （ 2）平板计数： 2h 后取出诱变菌液使用振荡器将离心管中的菌液混匀，用1000μL 移液枪吸取 置于装有 生理盐水的 7mL 离心管中，依次稀释至 10 10 10 106，取稀释倍数 10 105的两个梯度菌悬液（ 0s 取稀释倍数为 10 106 的两个梯度菌悬液涂布平板），用 200μL 移液枪吸取100μL 加入 MRS 平板，涂布均匀，每个稀释度做三个平行。 将涂布后的平板倒置放入恒温培养箱中， 30℃ 培养 72h。 （ 3） ARTP 致死率的计算：培养 72h 后对平板上的菌落进行计数，并与相对应浓度的对照组菌落数目进行对照，按照公式：致死率 =（对照组 诱变菌落数） /对照菌落数，计算致死率。 突变株的筛选 （ 1） 梯度平板的制备：在无菌操作台，先将平板倾斜 15 度左右放置，倒入约 10mL MRS 琼脂培养基，待凝固后放回水平位置，再倒入等体积的含有GABA 浓 度为 60g/L 的 MRS 培养基，凝固后形成梯度平板备用。 （ 2） 突变菌株的初筛：将诱变后菌株分别稀释 10 105涂布梯度平板，将涂布后的梯度平板倒置放入恒温培养箱中， 30℃ 培养 72h（ 0s 不需要涂布梯度平板）。 培养 72h 后按 GABA 浓度以及菌落的大小挑选单菌落；验证菌落大小和抗 GABA 浓度高低与菌株产 GABA 的相关性。 （ 3）突变菌株的复筛 ：对突变菌株利用发酵培养基进行复筛，发酵条件为装液量 50mL 的 250mL 的三角瓶。 在恒温培养 30℃ 静置培养 72h； 72h 后在640nm 条件利用酶标仪测突变菌株发酵产 GABA 的产量。 安徽工程大学毕业论文 徽工程大学毕业 设计（论文） GABA 含量的测定 取 1ml 发酵液于 离心管中 10000r/min 离心 2min，吸取 上清液用无菌水稀释 10 倍备用。 取 备用液于平底试管中。 再依次分别加入 1mol/L 的碳酸钠溶液， ， 6%的重蒸苯酚 ，混匀后加入次氯酸钠 (NaClO)溶液 2mL，混匀后放置 4～ 8 分钟，然后沸水浴 10min，立即冰浴 20min，待溶液出现蓝绿色后，加入 4mL 60%的乙醇溶液，混匀后室温 3 放置 20min，待上述溶液制作好后，从每组溶液中吸取 200μL 加入到酶标板上，用酶标仪在 640nm 条件下对每组溶液进行 GABA 的含量测定；用酶标仪测定 GABA 的标准。 图 31 GABA的酶标仪标准曲线 菌种保藏 对反复筛选并经过多次传代得到的高产 GABA 的乳酸菌突变菌株用甘油管在 70℃ 进行冷冻保种。 对乳酸菌 L1201进行 ARTP 诱变育种 菌种来源 L1201 是。