马铃薯m病毒重组cp抗血清的制备毕业论文(编辑修改稿)

马铃薯m病毒重组cp抗血清的制备毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

利用镍离子亲和层析法纯化出重组 CP，并进行透析、浓缩与定量。 3）利用高纯度重组 CP 免疫家兔制备出高效价抗血清。 4）抗血清效价测定及 PVM 的 ELISA 测定。 5 1 材料与方法 实验材料 实验菌株 重组菌 BL21(pET22bPVM)由本实验室构建并保存。 主要试剂 与仪器 三氯乙酸、 SDS、 Glycine、 Urea、 Acrylamide、 Bisarcylamide、二抗（上海生工）；咪唑（北京鼎国）；去氧胆酸钠（上海伯奥）；蛋白酶抑制剂 (PMSF)(Sigma)；蛋白质 Marker；溶菌酶（北京索莱宝）； 蛋白纯化柱 (HiTrap Chelating HP)(HE Heacthcare)。 其 它 试剂均为分析纯试剂。 超净工作台（安泰公司） 振荡培养箱（上海博迅） 电子天平（ Satorius） pH 仪（ DENVER） 观片灯（山东 兖州通用医疗器械有限公司 ） 恒温循环仪（北京六一） 聚丙烯酰胺凝胶制备系统（ BioRad） 微型垂直板电泳装置（ Miniprotean,BioRad） 水平脱色摇床（北京六一） 培养基 LB 固体和液体培养基， 调 pH 至 ,高压蒸汽灭菌 121℃ 下 15min。 氨苄抗性的筛选平板 主要试剂配方 12%分离胶： 蒸馏水 30% arcBis mL Tris(pH ) mL 10%SDS 180μL 10% Aps 180μL 6 TEMED 7μL 5%浓缩胶： 蒸馏水 30% arcBis 650μL Tris(pH ) 500μL 10%SDS 40μL 10% Aps 40μL TEMED 4μL 脱色液配制： 蒸馏 水 500ml 95%乙醇 400mL 冰醋酸 100ml PBS 配制： KH2PO4 Na2HPO4 NaCl 8g KCl 加去离子水 800mL，搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH 至 ，最后定容到 1L。 高温高压灭菌后室温保存。 考马斯亮蓝 G250（ 5）染液配制： 考马斯亮 蓝 G250 20mg 95%乙醇 10mL 浓磷酸 20mL 定容至 40mL， 4℃ 保存。 使用时，用 PBS 稀释为 1考马斯亮蓝 G 7 结合缓冲液： NaH2PO4 NaCl Urea 8M 咪唑 20mM 洗脱缓冲液： NaH2PO4 NaCl Urea 8M 咪唑 碳酸盐缓冲液（ pH ）： Na2CO3 NaHCO3 加去离子水 800mL，搅拌溶解，加入浓盐酸调 pH 至 ，最后定容到 1L。 PBST 洗涤缓冲液： PBS 缓冲液 100mL Tween20 50μL 封闭液： BSA 加 PBST 缓冲液至 5mL。 底物缓冲液（ pH ）： 柠檬酸 Na2HPO4 溶于去离子水中，调 pH ，定容至 100mL。 TMB 使用液： TMB（ 1mg/mL 溶于 DMSO） 1mL 底物缓冲液 9mL 30%H2O2 1μL 8 方法 PVMCP 基因原核表达的诱导与鉴定 1）用 接种环以无菌操作挑取重组菌 BL21(pET22bPVM)菌液一环，划线接种于含有 100181。 g/mL Amp 的 LB 固体培养液， 37℃ 培养 24h。 2）挑取重组菌 BL21(pET22bPVM)的单菌落接种在 10ml 含有 100181。 g/mL Amp的 LB 液体培养液， 37℃ 震荡培养过夜。 3）菌种按 1%的接种量接种于 200ml 含相同浓度 Amp 的 LB 液体培养基中，37℃ 震荡培养 小时左右，测 OD600 达到 可开始诱导。 4）诱导前，接出 1ml 未诱导的菌液作为对照。 5）向剩余培养液中加入 1%培养液体 积的 100mM IPTG(终浓度 1mM)诱导表达，37℃ 震荡培养 4h 左右。 6）接出 2mL 诱导的菌液分别装入 2 个 离心管中作为诱导样。 7） SDSPAGE 检测诱导效果。 菌体总蛋白的提取和包涵体的溶解 1）将上述步骤中剩余的 197ml 在 4℃下、 4000rpm 离心 15min。 2）弃去离心上清液，对沉淀进行称重，加入裂解缓冲液（每克大肠杆菌加入 3ml），将菌体重悬。 3)每克大肠杆菌中加入 8μ LPMSF（ 50mM）和 80μ L 溶菌酶（ 10mg/mL）。 4)边搅拌边加入少量去氧胆酸钠。 5)等待裂解液变稠，每克大肠杆菌中加入 20μ LDNaseⅠ (1mg/mL)。 6)室温下放置 30min 左右，至裂解液不再粘稠。 7)将裂解液分装在 离心管中，用微量离心机于 4℃、 12020rpm 离心2min。 8) 沉淀进行包涵体溶解：弃掉上清液，每管沉淀中加入 750μ L 结合缓冲液，吹打重悬沉淀，再加入 750μ L 结合缓冲液，震荡均匀，约 1min 后 4℃， 12020rpm，离心 10min；收集上清液，重复上述步骤，加入 750μ L 结合缓冲液吹打重悬，12020rpm， 4℃离心 15min，收集上清液。 9） 用滤膜将上清液过滤。 9 PVM 重组 CP 的纯化 使用 5mL 镍柱纯化目的蛋白 PVMCP，纯化体系如下： 1）用 20 mL ddH2O 洗柱，避免柱子中存有酒精。 2）用 mL 的 硫酸镍洗柱挂镍，活化纯化柱。 3）再用 20 mL ddH2O 洗柱将未挂上的镍洗掉。 4） 20mL 结合缓冲溶液平衡柱子。 5）过滤过的样品溶液 510mL。 6） 20 mL 结合缓冲溶液洗柱将未能结合上柱的蛋白洗掉。 7） 10 mL 洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集中间的 5 mL 洗脱液。 8） 40 mL ddH2O 洗柱。 9） 20 mL 20%乙醇洗柱，封柱， 4℃保存柱子。 纯化蛋白的 SDSPAGE 检测 PVMCP基因诱导表达的效果及重组 CP纯化效果都通过 SDSPAGE检测、确认。 蛋白的透析、浓缩与定量 收集蛋白纯化的洗脱液并将其装入透析袋中 ,封口后，于 4℃ ， 透析，后将透析袋放到 PEG6000 固体中浓缩 12h，对蛋白进行定量。 定量方法如下： 1）取 6 支试管并将其编号，然后分别将。