香菇多糖抗氧化增效剂的研究毕业论文(编辑修改稿)

香菇多糖抗氧化增效剂的研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

能力，不同增效剂对不同抗氧化剂的增效作用不同。 综合比较， TBHQ 加入柠檬酸及 EDTA 增效后对荔枝、芒果原果青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究 4 汁的抗氧化效果理想， VC 保存率均达到 85%以上。 李书国等 [23]以易氧化酸败的核桃油为试验原料 ， 取等量的 9 组样品 ， 将抗氧化剂 TBHQ、 PG、 BHT、 VE 及增效剂柠檬酸、抗坏血酸 （ VC） 分别以不同的组合方式和配比添加到上述 9 组样品中 ， 然后与空白样一起利用 Schall 烘箱法每隔 24 h 测一次过氧化值 （ POV），比较它们的氧化稳定性，得到最佳条件。 张燕平等 [24]从紫苏茎叶中提取抗氧化活性成分，并与茶多酚、维生素 E 比较。 实验得到在乙醇与碱水体积比为 8:2 混合提取时提取物达到最佳抗氧化效果，柠檬酸对其有很好的增效作用。 初步鉴定其活性成分为酚类，黄酮类化合物。 主要研究内容 （ 1） 香菇多糖、大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷的抗氧化性质 ； （ 2） 大豆多肽、大枣多糖、三七皂苷对香菇多糖的抗氧化增效作用 ； （ 3） 最佳香菇抗氧化增效剂的配比。 2 材料与方法 材料 原料 香菇、大豆粉、和田大枣，均购自青岛城阳大润发超市；三七，购自青岛城阳中药店。 试剂 木瓜蛋白酶 酶活 2020U/mg 杰辉生物技术有限公司 纤维素酶 酶活 15U/mg 上海博奥生物科技有限公司 无水乙醇 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司 抗坏血酸（ Vc） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 盐酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司 冰乙酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司 高氯酸 分析纯 莱阳康德化工有限公司 DPPH（二苯代苦味酰基自由基） 分析纯 美 国 Sigma 公司 青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究 5 铁氰化钾 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 邻二氮菲 亚铁 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 硫酸亚铁 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 双氧水 分析纯 洛阳市昊华化学试剂有限公司 磷酸二氢钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 磷酸氢二钠 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 Tris 分析纯 瑞士 Roche 公司 EDTA 分析纯 瑞士 Roche 公司 邻苯三酚 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 二硫苏糖醇（ DTT） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公 司 三氯乙酸（ TCA） 分析纯 天津市科密欧化学试剂有限公司 苯酚 分析纯 天津市天力化学试剂有限公司 仪器 方法 多糖、多肽、皂苷等活性物质的提取及制备 香菇多糖提取（超声波协同复合酶法） 新鲜香菇切碎，在 60℃ 下干燥至恒重， 粉碎后过 60 目筛。 取香菇粉 ，AR1140 电子分析天平 美国奥豪斯电子天平公司 电热恒温水浴锅 龙口市先科仪器公司 SHAB 型恒温振荡器 常州国华电器有限公司 UV2020 紫外可见分光光度计 上海尤尼柯电器有限公司 DU800 紫外 可见分光光度计 美国贝克曼库尔特有限公司 FDID80 冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司 868 型 pH 计 上海奥立龙电器有限公司 RE6000 旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂 SHZIII 型循环水真空泵 上海亚荣生化仪器厂 GBOF20CN1LDG(WO)型微波炉 Galanz 有限公司 TGL16M 高速台式冷冻离心机 长沙湘仪离心机仪器有限公司 青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究 6 按料液比 1： 20 加蒸馏水。 超声提取温度 60℃ ，时间 40min，调节 pH 值至。 称取适量复合酶（木瓜蛋 白酶：纤维素酶 =2： 1），加入 5mL 蒸馏水溶解。 香菇溶液预热至 55℃ ，加入酶液，恒温振荡。 反应结束后过滤，将滤液灭酶 10min。 冷却至室温后 4000r/min 离心，取上清液，醇沉，离心后取沉淀物。 冷冻干燥得香菇多糖粉末，低温保藏。 大枣多糖提取（微波辅助法） 干大枣切碎，在 60℃ 鼓风干燥箱中干燥至恒重， 粉碎后过 60 目筛。 取烘干粉碎的大枣粉 ，以 1: 30 的料液比加蒸馏水水浸 80 分钟，微波 400w 加热 4分钟，冷却，静置。 4000r/min 离心 10 分钟，取上清液，醇沉，离心，取沉 淀物。 冷冻干燥得大枣多糖粉末，低温保藏待用。 三七皂苷粗提物提取（醇提法） 将三七放置在烧杯中，用蒸馏水浸泡 48 小时，粉碎成细小块状，过滤，滤渣放置烘箱中烘干， 将 滤液蒸发浓缩。 取三七样品 ，加 20mL 60%的乙醇连续浸提两次，每次 ，过滤，除去滤渣。 合并提取液，在 50℃ 下 蒸发 浓缩。 浓缩液干燥至恒重，密封保存备用。 大豆多肽的制备（碱溶酸沉协同酶解法） 取 大豆粉，按料液比 1: 10 加入蒸馏水，用 NaOH 调 pH 值为 ，水浴50℃ 振荡 30min，冷却，离心。 取沉淀物按照上述方法重复处理，将两次上清液合并，调节其 pH 值为 ，静置 20min。 离心后所得沉淀物即为大豆蛋白。 真空冷冻干燥 ，低温 保存。 采用考马斯亮蓝法测蛋白含量 [25] 测得浓度为 34μg/mL，取料液比 1: 30，调 pH 至 ，温度 60℃ ，加入 %的木瓜蛋白酶水解 2h， 100℃ ，5min 终止水解。 5000r/min 离心，取上清液，冷冻干燥备用。 四种提取物含量测定 多糖含量测定 香菇多糖及大枣多糖提取液经淀粉 KI试验无颜色变化，采用硫酸 苯 酚法 [26] 测定其 多糖 含量。 皂苷含量测定 比色法测定总皂苷含量 [27]。 青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究 7 标准曲线的绘制：准确称取 5mg 人参皂苷对照品，加乙醇定容至 5mL，配置成 1mg/mL 皂苷溶液。 分别吸取 60、 80、 100、 1 1 160、 180μL标准液于具塞试管中，水浴挥发溶剂，加入新配置的 5%的香草醛－冰乙酸溶液 和高氯酸 ，于 60℃ 水浴中加热 15min，流水冷却后加入 5mL 冰乙酸，摇匀，放置 15 分钟，以相应试剂做空白对照，用紫外分光光度计在 560nm 处测得吸光值，绘制标 准曲线。 标准 曲线 方程为： A=＋ (r2=）。 含量测定：吸取样品溶液 ，依照标准曲线操作步骤测定。 多肽含量测定 大豆多肽提取液采用 BCA法测定肽含量 [28]。 取 20μL肽液于离心管中，加蒸馏水至 2mL，混匀，得 100 倍稀释液。 取 20μL稀释液，加 200μLBCA摇匀，平行三组，一组空白对照， 37℃ 下静置 1h。 在 562nm处测定吸光值。 根据标准曲线测肽含量。 不同提取物抗氧化实验 体外抗氧化实验分别测定香菇多糖、 三七皂苷、大枣多糖、大豆多肽四种提取物的还原能力、 DPPH 和羟自由基 （ OH） 清除能力，分别得到清除率曲线并计算出四种物质的 IC50 值，比较它们抗氧化能力的大小。 具体方法如下： 还原能力的测定 —— 铁氰化钾还原法 [29] 清除 DPPH 自由基能力 —— 改进的 Nagai 法 [30] DPPH（二苯代苦味酰基自由基）是一种很稳定的自由基，在乙醇溶液中呈现深紫色，在 517nm 处有最大吸收峰。 当有自由基清除剂（ AE）存在时其单电子被结合而使其 颜色减退，在最大吸收波长处吸光值最小，减小的程度与清除剂的清除能力及数量成定量关系。 清除羟自由基的活性 [31] 采用邻二氮菲 亚铁法。 过氧化氢与亚铁体系通过 Fenton 反应产生 OH，亚铁离子可被 OH 氧化成铁离子，邻二氮菲 亚铁在 536nm 处的最大吸收峰随之消失。 提取物与香菇多糖配比增效实验 根据还原能力实验和自由基清除率实验结果，得到具有相同还原能力和相同DPPH和 OH 清除能力下不同提取物的浓度。 按照相应的浓度将大豆多肽、三七青岛农业大学学士学位论文 香菇多糖抗氧化增效剂的研究 8 皂苷和大枣多糖分别与香菇多糖按 体积比 1:1 搭配起来。 测定混合物的还原能力、DPPH 清除能力及羟自由基清除能力大小，研究其增效作用。 最佳搭配物质与香菇多糖的抗氧化最佳配比实验 根据提取物与香菇多糖的抗氧化配比增效实验，得到大豆多肽、三七皂苷和大枣多糖三种代表提取物中的最佳香菇抗氧化增效剂。 按照最佳的增效剂和香菇多糖的质量比 1:9， 2:5， 3:7， 4:6， 5:5， 6:4， 7:3， 8:2， 9:1 进行还原能力 、 清除DPPH能力和 OH 能力实验，综合得到最佳配比。 3 结果与讨论 四种提取物抗氧化能力的测定 四种提取物还原能力测定 香菇多糖、三七皂苷、大枣多糖、大豆多肽的还原能力测定结果见图 1。 图 1 还原力曲线 Fig. 1 Curve of reducing power 还原能力以测得的吸光值 A700大小表征其大小，吸光值越大，测得样品的还原能力越强。 由图 1 可知，四种提取物的还原能力在一定浓度范围均与其浓度呈正相关。 在相同的还原能力下，选定 A700为 时，各提取物浓度如下：大豆多肽 12mg/mL，大枣多糖 6mg/mL，香菇多糖 1mg/mL，三七皂苷为。 结果表 明：在 A700 为 ~ 的范围内，在同一吸光值下所需各提取物浓度按三七皂苷、香菇多糖、大枣多糖、大豆多肽的顺序递增；在 A700为其他浓度时，四种提取物物也近似呈现类似变化趋势。 故在一定浓度范围内，四种提取。