食用菌工厂化生产污染菌的研究毕业论文(编辑修改稿)

食用菌工厂化生产污染菌的研究毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

方：肉汁胨培养液 100ml， KNO3 lg， ，每管分装 45ml 试剂： (1)格里斯氏试剂 (2)二苯胺试剂 将测定菌接种于硝酸盐液体培养基中，置适温培养 5d。 每株菌做 3 个重复，另留两管不接种作对照。 在两支干净的空试管中倒入少许培养 5d 的培养液，再各加一滴 A 液及 B 液，在对照管中同样加入 A 液， B 液各一滴。 结果观察：当培养液中滴入 A、 B 液后，溶液如变为粉红色、玫瑰色、橙色、棕色等表示亚硝酸盐存在，为硝酸盐还原阳性。 如无红色出现，则可加入一、二滴二苯胺试剂，此时如呈蓝色反应，则表示培养液中仍有硝酸盐，又无亚硝酸盐反应，表示无硝酸盐还原作用：如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其它物质，故仍按硝酸盐还原阳性处理。 碳源的利用 常熟理工学院毕业设计（论文） 7 培养基 ： (NH4)2SO4 ， NaH2PO4 • H2O ， K2HPO4 ， MgSO4 • 7H2O ，CaCl2 • 2H2O ，蒸馏水 1000ml，含碳化合物 ％， pH 177。 用菌体悬液，每一个测定菌都须接种未加合碳化合物的空白基础培养基作为对照。 适温培养 14 天观察。 凡测定菌在合有碳水化合物培养基中的生长情况明显超过空白基础培养基的生长情况者为阳性。 否则为阴性。 如两种培养基上的生长情况差别不明显，可在同一培养基上连续移种三次。 如生长差别仍不 明显，则按阴性处理。 卵磷脂酶测定 培养基：无菌条件下取卵黄加等量的生理盐水，摇匀后，取 10ml 上述悬液加入到融化的、约 5055℃的 200ml 牛肉膏蛋白胨中，混合均匀后倒人培养皿内。 制成的卵黄平板过夜后即可使用。 取 1824h 的斜面或培养液中的菌体点种在上述平板上。 在菌落四周围和下面有不透明的区出现，表示卵磷脂分解生成脂肪，说明有卵磷脂酶。 精氨酸双水解反应 培养基：蛋白胨 1g，酚红 ，牛肉膏 5g， L精氨酸盐 10g， K2HP04 ，蒸馏水1000ml，琼脂 6g， ，分装试管，高度约 45cm。 用幼龄菌种穿刺接种，并用凡士林油封管，适温培养 14 天观察。 培养基转为红色者为阳性，应有不含精氨酸空自做对照。 运动性的检查 半固体琼脂穿刺法。 用直引穿刺接种试验菌于半固体培养基内，于适温培养。 细菌的运动性可用透过光目测。 如生良物只生长在穿刺线上，边缘十分清晰，则表示试验菌无运动性。 如生长物由穿刺线向四周呈云雾状扩放，其边缘呈云雾状，则表示试验菌株有运动性。 对生长快的细菌应培养一天后观察。 如第一第不能判定可在第 2— 3 天再观察。 如 2— 3 天时 仍不能明确判定是否有运动性，可延迟到 5— 6 天再观察一次。 因为游动力弱的细菌，在半固体培养基中第 12 天中尚不能从穿刺线游开，故需多培养几天观察。 如实验菌在半固体培养基中产气，气泡将穿刺线上的生长物挤乱。 此时应注意生长物的扩散情况，不可误将不运动的细菌判为有运动性。 如试验菌品好痒细菌．穿刺线上生长物很少，可检常熟理工学院毕业设计（论文） 8 查从培养基表面向下渗入的生长物的情况。 16S rDNA 序列 提取及测序 委托宝生物工程（大连）有限公司测序 变性 在培养基中挑取菌体于 50ul TaKaRa Lysis Buffer for Microanism to Direct PCR(Code )中变性后离心取上清作为模板。 反应条件： 80℃， 15 min PCR 扩增 使用 TaKaRa 16S rDNA Bacterial Identification PCR Kit（ Code ），进行 PCR扩增目的片段。 反应条件： 94℃ 5 min 1 cycle m m in155m in194℃℃℃ 30 cycles 72℃ 5 min 1 cycle 反应体系 : 上述 1 的变性反应液 1 ul PCR Premix 25 ul Forward primer(20pmol/ul) Reverse primer2(20pmol/ul) 16Sfree H2O 23ul Total 50ul 取 5 ul 进行 3%琼脂糖凝胶电泳 使用 TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit （ Code No. D823A）切胶回收目的片段进行 DNA 测序。 测序 常熟理工学院毕业设计（论文） 9 以 Seq Forward、 Seq Internal 和 Seq Reverse 为引物进行 DNA 测序。 抑菌剂的筛选 细菌鉴定系统试剂卡药敏鉴定 使用细菌鉴定系统中的药敏试剂卡对病害菌进行多种抗生素的抑菌实验。 取适量待检菌株置于药敏培养液中，用无菌加样滴管取药敏试验菌液加入药敏试验孔中，每孔加试验菌液 150μl。 盖上卡片盖板，将卡片置于 35℃培养箱中，培养 1624h 后，取出卡片，即可人工目测结果。 常用抗生素抗性试验 采 用 滤纸片 法，以抑菌圈的大小，测定杀菌效果。 本试验采用纸碟法： 取 用平板涂布法将菌混匀密布于生长培养基的平板，同时以无菌镊子取含抗生素的纸片于含菌平板上，置 30℃ 培养 2448h 后，取出观察抑菌圈大小。 读取结果 ， 以所测抑菌圈的平均直径 (mm)来表示药剂对细菌的抑菌力。 (05mm)无作用， (615mm)弱作用， (15mm)强抑制作用 [14]。 3．结果与分析 污染杏鲍菇样本的性状描述 图 1 菌丝包和菇体样本污染图 The sample figure of pollution during mycelial and fruiting bodies growth 从图 1 可以看出，污染杏鲍菇的样本在菌丝生长阶段，在料袋上出现零星的黄色水珠，黏度不大，这一现象导致菌丝长满袋的时间延长 57d；且这现象一般出现在袋口附近，缓慢向下蔓延至整个料包的 1/4 为止。 出现这种现象的料包在菌丝长满之后进入出菇环节，经过正常的消毒环节后，会长出子常熟理工学院毕业设计（论文） 10 实体，但随着子实体的增大，菇体会出现大量黄色粘稠状水珠，随着培养时间的延长，被污染的菇体最终会腐烂，而与之接触的健康菇体也会被感染出现相同的症状。 在菌丝生长阶段，若在无菌条件下去除黄色水珠，会大幅度降 低后期菇体的污染情况以及推迟出现黄色粘稠液体的时间。 因此断定，菌丝生长阶段出现的黄色水珠与后期在子实体上的黄色液体为同一菌株的胞外分泌物。 污染病 原 菌的分离 分别挑去菌丝料包上的水珠和污染菇体，进行涂布培养。 结果表明，两个样本的培养结果类似，均出现了两种细菌，证实了这一污染现象是由两种微生物引起，分别为 CTE 722B 和 CTE 722C；只是两者比例有差异，前者 CTE 722C 较多， CTE722B 较少，后者则反之。 在培养基培养 24h， CTE722B为半透明、淡黄色的圆形菌落，表面隆 起，边缘略粗糙； CTE722C 为半透明、乳白色的圆形菌落，边缘整齐光滑； CTE722B 的菌落直径较 CTE722C 的大。 图 2 涂布培养结果 The result of polluted sample coated culture 病原菌的 固体培养特征 2 个菌株在牛肉膏蛋白胨平板上生长 24h 后， 观察其形态特征 见表 表 菌株 S S2 在 4 种固体培养基上的培养特征比较 培养基 菌株 S1 S2 营养琼脂 菌落圆形，半透明，乳白色，表面多皱，隆起，边缘略粗糙 菌落圆形 ， 半透明，乳白色，边缘整齐，光滑发亮 LB 琼脂 菌落圆形，半透明， 杏仁白色，表面光滑湿润，平坦，边缘平整 菌落圆形，半透明，乳白色，表面光滑湿润，平坦，边缘平整 金氏等 A 培养基 无水溶性产生 无水溶性产生 CTE 722B CTE 722C 常熟理工学院毕业设计（论文） 11 金氏等 B 培养基 无非水溶性色素产生 无非水溶性色素产生 病原菌的 个体 形态 特征 通过普通光学显微镜对菌株 S S2 的菌体形态进行观察，结果（见表 、图 、图 、图 ） 表 菌株 S S2 个体形态的比较 染色方法 菌株 S1 S2 革 兰氏染色 革兰氏阴性，短杆状 革兰氏阴性，短杆状，近似球状 芽孢染色 无芽孢 无芽孢 图 菌株 S1 的芽孢染色结果 16S rDNA 序列分析 为进一步确定菌株的分类位置，对其 16S rDNA 序列进行了分析，结果见表 下表 菌株 S1 的 16S rDNA 序列分析 表 菌株 S1 的 16S rDNA 序列 常熟理工学院毕业设计（论文） 12 ACGCTGGCGG CAGGCCTAAC ACATGCAAGT CGAGCGGATG AGAAGAGCTT 50 GCTCTTCGAT TCAGCGGCGG ACGGGTGAGT AATGCCTAGG AATCTGCCTG 100 GTAGTGGGGG ACAACGTTTC GAAAGGAACG CTAATACCGC ATACGTCCTA 150 CGGGAGAAAG CAGGGGACCT TCGGGCCTTG CGCTATCAGA TGAGCCTAGG 200 TCGGATTAGC TAGTTGGTGA GGTAATGGCT CACCAAGGCG ACGATCCGTA 250 ACTGGTCTGA GAGGATGATC AGTCACACTG GAACTGAGAC ACGGTCCAGA 300 CTCCTACGGG AGGCAGCAGT GGGGAATATT GGACAATGGG CGAAAGCCTG 350 ATCCAGCCAT GCCGCGTGTG TGAAGAAGGT CTTCGGATTG TAAAGCACTT 400 TAAGTTGGGA GGAAGGGCAT TAACCTAATA CGTTAGTGTT TTGACGTTAC 450 CGACAGAATA AGCACCGGCT AACTCTGTGC CAGCAGCCGC GGTAATACAG 500 AGGGTGCAAG CGTTAATCGG AATTACTGGG CGTAAAGCGC GCGTAGGTGG 550 TTTGTTAAGT TGGATGTGAA AGCCCCGGGC TCAACCTGGG AACTGCATCC 600 AAAACTGGCA AGCTAGAGTA CGGTAGAGGG TGGTGGAATT TCCTGTGTAG 650 CGGTGAAATG CGTAGATATA GGAAGGAACA CCAGTGGCGA AGGCGACCAC 700 CTGGACTGAT ACTGACACTG AGGTGCGAAA GCGTGGGGAG CAAACAGGAT 750 TAGATACCCT GGTAGTCCAC GCCGTAAACG ATGTCAACTA GCCGTTGGAA 800 TCCTTGAGAT TTTAGTGGCG CAGCTAACGC ATTAAGTTGA CCGCCTGGGG 850 AGTACGGCCG CAAGGTTAAA ACTCAAATGA ATTGACGGGG GCCCGCACAA 900 GCGGTGGAGC ATGTGGTTTA ATTCGAAGCA ACGCGAAGAA CCTTACCAGG 950 CCTTGACATG CAGAGAACTT TCCAGAGATG GATTGGTGCC TTCGGGAACT 1000 CTGACACAGG TGCTGCATGG CTGTCGTCAG CTCGTGTCGT GAGATGTTGG 1050 GTTAAGTCCC GTAACGAGCG CAACCCTTGT CCTTAGTTAC CAGCACGTT。