牛乳中抗生素残留的检测_本科生毕业论文(设计)(编辑修改稿)

牛乳中抗生素残留的检测_本科生毕业论文(设计)(编辑修改稿)内容摘要：

有费用低，操作简便，可靠性高等特点。 但该方法必须经过几个小时才能观察到结果，测定的结果与试验菌株的敏感性，琼脂平板中的试验菌株数，培养基及其成分的 pH 值有关，且通过肉眼判断显色状态，容易产生误差。 目前常用的两种方法是纸片法（ PD 法）和 TTC 法。 纸片法 常用的纸片法包括枯草杆菌纸片法和嗜热脂肪杆菌纸片法 [9]，主要用于检测牛奶中的 β内酰胺类抗生素。 枯草杆菌纸片法只适用于 β内酰胺类抗生素的检测，检测限为 ，而嗜热脂肪杆菌纸片法不仅适用于 β内酰胺类抗生素的检测，他还可检测到奶样中其它抗生素的存在，检测限为。 TTC 法 TTC 法，即氯化三苯四氮唑试验，它是目前我国食品卫生标准中规定的检测牛奶中抗生素残留的检测方法 [10]。 此方法为向检样中加入嗜热乳酸链球菌和 TTC 试剂， 通过观察显色状态的变化判定检样中有无抗生素存在。 乳样中有抗生素存在，则在向检样中加入菌液培养时细菌不增殖，此时由于加入的指示剂 TTC 不还原，所以不显色。 相反，如果没有抗生素存在，则加入菌液即进行增殖， TTC 被还原而显红色。 也就是说当检样呈乳的原色时为阳性，微红色是为可疑，桃红色或红色时为阴性。 目前 TTC 法检测的各种抗生素灵敏度如下：青霉素为 单位、链霉素 单位、庆大霉素 单位、卡那霉素 5 单位。 DelvotestSP（ 戴尔沃检测法） DelvotestSP 检测 法是由荷兰 Gistbrocades BV 公司开发的。 其与先前的 DelvotestSP 相似，但用时更短，只需培养 2h，对青霉素的检测灵敏度提高到。 它可检测的抗生素种类更多，包括青霉素 G、氨苄青霉素、头孢噻林、新霉素、土霉素、阿莫西林、螺旋霉素、磺胺二甲嘧啶、磺胺嘧啶、四环素、金霉素、红霉素、庆大霉素、卡那霉素、林可霉素、氯霉素、泰乐菌素和甲氧苄氨嘧啶等。 ， DelvotestP 和 DelvoXPress 两种检测方法得出以 下结论： DelvoXPress 能准确测定原料奶中的 β 内酰胺类抗生素，可应用于农场外散装原料奶的检测 [11]。 由于使用快速方便，价格更低，因此适合奶牛场的抗生素快速检测。 黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计） 5 其它方法 Brilliant Black Reduction Test(亮黑裉色试验 )是另一种重要的检测方法，包括德国的 AiMAanlytikin Mitch Productionund Vertiebs Aim 和荷兰的 Gist Brocades 等。 它所用的菌种为嗜热脂肪芽孢杆菌。 阴 性样品呈黄色，否则呈蓝色。 目前仍有许多关于新技术和方法的报道，如 Gaudin 发表了生物传感器方法测定 β 内酰胺类抗生素残留方法。 理化检测法 理化检测方法的原理是利用抗生素分子中的基团所具有的特殊反应或性质来测定其含量 [12]。 它包括波谱法、色谱法及其联用技术，如 HPLC、 GC、薄层色谱法（ TLC）、毛细管电泳 （ CE）等。 理化检测法具有灵敏度高，可进行准确定性分析（ 给出被测组分的结构信息）和定量分析能力的优点， Takeba 等人已经成功地使用 HPLC 同时检测出牛奶中三氯苯达唑及其代 谢产物亚砜和砜； Pollmeier 更是在十亿分之的水平上检测出牛奶中的阿维菌素类似物乙酰氨基阿维菌素。 但理化检测程序复杂，且费用较昂贵。 最常用的方法为高效液相色谱法和联用技术。 高效液相色谱法 HPLC 是在经典的液相色谱法基础上发展起来的。 通过引入气相色谱的理论和技术，发展了高分离效能的色谱柱和高灵敏感性的检测器，特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物的分析，因此，高效液相色谱法成为目前广泛应用的一种抗生素残留检测手段。 HPLC 使用的检测器 目前在残留 分析中使用的主要 HPLC 检测器为紫外可见（ UVD）、荧光（ FLD）和电化学 (Echo）检测器。 UVD 是应用最早和最广泛的 HPLC 检测器。 目前绝大多数 HPLC 系统都配备有该种检测器。 其灵敏度高，选择性较好，能满足残留分析的一般要求。 UVD 对环境温度，流动相组成和流速变化不敏感，能适应等度和梯度洗脱 [13]，对强紫外吸收的物质的检测限可以达到 1ng 以下。 在许多常规分析中，HPLC/PDA 是一种简便的定性分析方法。 联用技术 各种分析技术联用是现代兽药残留分析的发展趋势。 它一 般集分离、定量和定性于一体，特别适用于确证性分析。 张素霞等报道了用 M SPDHPLCUV 分析法检测黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计） 6 牛奶中四环素类药物残留。 样品平均回收率为 % ～ % ，变异系数在 % ～ % 之间，方法检测限为 ～ ；贾薇等建立了一种用 C18 小柱进行固相萃取，液相色谱 质谱联用仪检测牛奶中 4 种四环素类的方法，每毫升牛奶中含四环素、土霉素及美他环素为 ，金霉素 ；而 Van Bruiynsvoort 则成功运用色谱联用技 术测定了牛奶中的链霉素和二双氢链霉素。 常见的联用技术包括： GCM S、 LCM S、 SFCM S、 CZEM S 等。 目前 GCM S 应用较多，而 LCM S 是除 GCM S 之外，又一种集高效分离和多组分定性、定量于一体的系统。 快速检测试剂盒 微生物法 荷兰 Gistbrocades BV 公司开发了 DelvotestP， DelvotestSP， Delvotest Cow Test，DelvotestMCS 检测系列 [14]。 DelvotestP 成型于 20 世纪 70 年代， 主要用于检测内酰胺类抗生素，装在小型安碚瓶或者微孔板微孔中的琼脂里，含有用微胶囊包裹的标志微生物嗜热硬脂酸芽孢杆菌 (Bacillusstearothermophilus)的芽孢和 pH 指示剂 (溴甲酚紫 )，同时包装内附有一瓶营养药片，检验时将营养药片与乳样同时放在培养基上，在 64e温度下培养 3h，培养基颜色由紫变黄表明抗生素残留阴性，颜色不变表示阳性。 琼脂装在小型安碚瓶里的格式适用于小规模和单个试验，微孔板格式一次可以同时检测96 个乳样，适用于大批量乳样检验。 DelvotestP 已经在全世界通用，可以检测到。 DelvotestSP 则可以检测包含 B内酰胺类抗生素在内的更多抗生素 (如磺胺类、泰乐霉素、红霉素、链霉素、庆大霉素、三甲氧卞二氨嘧啶等 )。 DelvotestSP 的用法基本与 DelvotestP 相同，只是培养时间缩短为 2h，对青霉素G 的敏感度可以提高到 ~。 Delvotest Cow Test 与 DelvotestP 小型安碚瓶格式除外装不同外，内容物和用法基本相同，还配有加热池，更适合牛奶场使用。 Delvotest MCS 是 DelvotestSP 的微孔板格式，但营养试剂已直接加入琼脂内，使用时无需再添加营养药片，操作更方便，但保质期短，适合于大型检测中心使用。 免疫法 Snap 法是美国 IDEXX Laboratories Inc 公司采用酶联免疫吸附 (ELISA)原理，将酶化学反应的敏感性和抗原抗体免疫反应的特异性相结合的方法，其敏感性和特异性较好。 在需要检测其他种类的抗生素时，可以选用对应的试剂盒进行检测。 在检测结黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计） 7 果方面，不仅可以知道结果的阴性阳性，而且也可了解所检测的结果是哪一类抗生素。 Snap 快速检测法耗时 9min，结果重现性好， 操作简便，但实验成本较高。 基于受体分析法 比利时 UCB Byproducts 公司开发的 BetaSTAR 检测法是将特定的 B内酰胺受体蛋白固定在试纸上，用胶体金有色微粒作为标记物， 5min 内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。 美国 Charm Science 公司 Charm MRL 检测法与 BetaSTAR 检测法形式十分相似，在 8min 内可以检测到青霉素和头孢菌素残留。 比利时 UCB Byproducts公司开发的 Penzym 检测法有两种形式 :Penzy 和 PenzymS，它们的区别是培养时间和灵敏度 不同，此方法适用于检测 B内酰胺类和头孢菌素类抗生素。 本实验研究的目的与意义 牛奶是营养最全面的营养品。 但饮用含有抗生素残留的牛奶可引起细菌耐药性 ， 导致人体过敏反应等症状。 经常饮用抗生素超标的牛奶还会破坏人体道菌群平衡。 抗生素的影响使酸奶 、奶酪等一些高质量的牛乳产品无法加工生产，造成大量的原料奶浪费，致使企业遭受很大的经济损失。 牛奶中抗生素残留问题日益受到社会各界的重视。 抗生素检测的方法、 检测技术也随之迅速发展，只有简便 、快速 、准确 、灵敏性高的检测方法才能满足日趋严格的检测要求。 保障人们饮用牛奶的卫生和安全。 抗生素的检测方法很多， 主要可以分为微生物测定法、理化测定法和免疫学测定法 [15] 等。 本实验通过国标 TTC法和试剂盒法、纸片法检测结果的比较为抗生素残留快速检测方法的补充提供理论依据。 黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计） 8 第二章 实验材料和方法 实验材料 材料 从哈市食品商场随即采取六个主要品牌不同品种的袋装消毒纯牛奶及其相关品牌的花色奶作为检样，将采集的样品编号，送实验室检测，乳样共计 13份，见表 21。 表 21 原材料表 品种 编号 规格 （ ml） 来源 纯牛奶 1 220 市售 2 220 市售 3 220 市售 4 220 市售 5 220 市售 6 220 市售 花色奶 7 280 市售 8 250 市售 9 220 市售 10 280 市售 11 240 市售 12 250 市售 13 220 市售 黑龙江东方学院本科生毕业论文（设计） 9 对照试验样品的采样，见表 22。 表 22 对照样品表 对照样品 编号 来源 脱脂乳 +青霉素 14 脱脂乳 : 东北 农大食品实验室提供 青霉素 : 天林药业有限公 司提供 灭菌生理盐水 +青霉素 15 NaCL: 天林药业有限公司提供 青霉素 : 天林药业有限公司提供 无抗脱脂乳 16 市售 灭菌生理盐水 17 市售 嗜热乳酸链球菌，由东北农业大学乳品研究中心提供； 枯草芽孢杆菌， 由 黑龙江东方学院微生物实验室。