年产1000吨淀粉酶生产工艺设计(编辑修改稿)

年产1000吨淀粉酶生产工艺设计(编辑修改稿)内容摘要：

上升，菌体衰老， 80％形成空泡，每 2～ 3 小时取样分析一次，当酶活不再武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 4 升高，可结束发酵。 而后向发酵液中添加 2%CaCl2， %Na2HPO4， 50～ 55℃加热处理 30分钟，以破坏共存的蛋白酶，促使胶体凝聚而易于过滤。 冷却到 35℃，加入硅藻土为助滤剂过滤。 滤液加 ，洗涤同发酵液 混合 ，真空浓缩数倍后，加（ NH4） 2SO4盐析，盐析物加硅藻土后压滤，滤饼于 40℃烘干，磨粉而成。 按此工艺，由酶液到粉状酶制剂的收率为 70％。 对于固体发酵有以下缺点 [13]： 1. 限于低湿状态下生长的微生物，故可能的流程及产物较受限，一般较适合于真菌。 2. 在较致密的环境下发酵，其代谢热的移除常造成问题，尤其是大量生产时，常限制其大规模的产能。 3. 固态下各项参数不易侦测，尤其是液体发酵的各种探针不适用于固体发酵， pH值、湿度、基质浓度不易调控， Biomass不易量测，每 批次发酵条件不易一致，再现性差。 4. 不易以搅拌方式进行质量传递，因此发酵期间，物质的添加无法达到均匀。 5. 由于不易侦测，从发酵工程的观点来看，许多工作都只是在定性或观察性质，故不易设计反应器，难以量化生产或设计合理化的发酵流程。 6. 固体发酵的培养时间较长，其产量及产能常低于液体发酵。 7. 萃取的产物常因黏度高不易大量浓缩。 而对于 发酵罐深层培养具有生产周期短、产量高、效益大等优点 故选用 层发酵法生产 α 淀粉酶。 工艺 流程简述 菌种的选育及制备 菌种选择性分离的步骤一 般是： 含微生物材料采集 —— 标本材料的预处理 —— 菌种的分离 —— 富集培养 —— 菌种初选—— 菌种复选 —— 性能鉴定 —— 菌种保藏。 土壤是微生物聚集最丰富的场所，菜园和农田耕作层土壤含有丰富的有机物常以细菌和放线菌居多，由于枯草芽孢杆菌生活在中性的环境中，可以采集中性的土壤。 采集后 可用平板划线法进行菌种分离。 由于野生型菌株生产性能较差， 可进行 诱变育种 ， 利用物理、化学因素诱导遗传特性发生变异，再从变异群体中选择符合人们某种要求如高产的个体。 培养基的配制 1） 培养基的类型 培养基的种类很多 ， 可以根据组成 、 状态和用途等进行分类，按照用途可以分成孢子培养基 ， 种子培养基和发酵培养基。 微生物大规模发酵设计主要用到孢子 ,种子和发酵培养基这三种类型。 2） 孢子培养基 孢子培养基配制的目的 是 供菌体繁殖孢子的，常采用的是固体培养基，对这类培养基的要求是能使菌体生长快速，产生数量多而优质的 孢子 ，并且不会引起菌体变异。 对孢子培养基的要求： ① 营养不要太丰富； ② 所用无机盐的浓度要适量； ③ 注意培养基的 pH和湿度。 淀粉酶的孢子培养基配置如下：将麸皮 5％、豆饼粉 3％、蛋白胨 %、琼脂 2%（ pH ）制成斜面培养基，在 20 min。 武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 5 3） 种子培养基 种子培养基是供孢子发芽、生长和大量繁殖菌丝体，并使菌丝体长得粗壮成为活力强的种子。 对于种子培养基的营养要求比较丰富和完全，氮源和维生素的含量也比较高些，浓度以稀薄为好，可以达到较高的溶解氧，供大量菌体生长和繁殖。 α 淀粉酶的种子培养基的配置：将豆饼 1%、 蛋白胨和酵母膏各 %、氯化钠 %配置成种子培养基 (pH ～ )，在 20 min。 4） 发酵培养基 发酵培养基的要求是营养要适当丰富和完全适合于菌种的生理特性和要求， 使菌种迅速生长、健壮，能在比较短的周期内充分发挥产生菌合成发酵产物的能力，但要注意成本和 能耗。 α 淀粉酶的发酵培养基配方是：麸皮 70％、小米糠 20％、木薯粉 10%、烧碱 %，加水使水量达 60％，常压蒸汽灭菌 1h。 种子扩大培养 本发酵属于一级种子罐扩大培养，二级发酵。 设计流程如下： 孢子 → 锥形瓶 → 种子罐 → 发酵罐 1） 孢子制备 将保存在淀粉琼脂斜面上的枯草 芽孢杆菌 孢子用无菌水洗下，接种到锥形瓶中，在 35℃静置培养 2～ 4天，待长出大量孢子 后 作为接种用 的 种子。 2） 种子制备 将保藏的菌种接种到 马铃薯茄子瓶斜面（ 20%马铃薯煎出汁加 MgSO47H2O 5 mg/L ，琼脂 2%， pH ～ ） ， 37℃ 培养 3 天。 然后接入到 20L种子罐， 37℃ 搅拌 ， 通风培养 12～14 小时。 此时菌种进入对数生长期（镜检细胞密集，粗壮整齐，大多数细胞单独存在，少数呈链状，发酵液 pH ～ ,酶活 5～ 10U/mL） ， 再接种到发酵罐。 3） 发酵罐培养 培养基的配制：用麦芽糖液配置成含麦芽糖 6％、豆粕水解液 6％～ 7％、 Na2HPO412H2O ％、 (NH4)2SO4 ％、 CaCl2 ％、 ％、豆油 1kg、深井水 20L，调 pH至 ～。 发酵 罐培养基经消毒灭菌冷却后接入 3%～ 5%种子培养成熟液。 培养条件为：温度37177。 1℃ ，罐压 ／ cm2，风量 1～ 20h 为 1： ， 20 h 后 1： ，培养时间为 28～ 36 h。 空气灭菌 此课题为好氧发酵，以空气作为氧源。 根据国家药品质量管理规范的要求，生物制品、药品的生产场地业需要符合空气洁净度的要求。 获得无菌空气的方法有：辐射灭菌、化学灭菌、加热灭菌、静电除菌、过滤介质除菌等。 过滤介质除菌是 目前发酵工业中空气除菌的主要手段，其介质有棉花过滤器、超细玻璃纤维纸、石棉滤板、金属烧结管等。 武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 6 1） 过滤除菌流程及设备 流程如下： 采风塔 → 空气粗过滤器 → 空气压缩机 → 储气罐 → 冷却器 → 旋风分离器 → 冷却器 → 丝网除沫器 → 空气 加热器 → 总空气过滤器。 设备如下： ：采风塔建在工厂的上风头，高至少 10 m,气流速度 8 m/s。 ：主要作用是拦截空气中较大的灰尘以保护空气压缩机，同时起一定的除菌作用，减轻总过滤器的负担。 ：作用是提供动力，以克服随后各设备的阻力。 ：作用 是消除压缩空气的脉动。 要求： H/B=2～ V=（ ～ ） V1 其中， H为罐高； B为罐直径； V1为空压机每分钟排气量（ 20℃ ， 1105Pa 状况下）。 ：是利用离心力进行气 固或气 液沉降分离的设备。 作用是分离空气中被冷却成雾状的较大的水雾和油雾粒子。 ：空压机出口温度气温在 120℃ 左右，必须冷却。 另外在潮湿的地域和季节还可以达到降湿的目的。 ：可以除去空气中绝大多数的 20181。 m 以上的液滴和 1181。 m以上的雾滴，一般采用规格为直径 ㎜ 40 孔且高度为 150㎜的不锈钢丝网。 ：列管内走空气，管外走蒸汽。 可将空气湿度由 100%降低到 70%以下。 ：填充物按下面顺序安装：孔板 → 铁丝网 → 麻布 → 活性炭 → 麻布 → 棉花 → 麻布 → 铁丝网 → 孔板。 介质要紧密均匀，压紧一致，上下棉花层厚度为总过滤层厚度的 1/4，中间活性炭层为 1/3。 2） 无菌空气的检查 现在采用的无菌 检查 实验方法有肉汤培养法、斜面培养法和双碟培养法。 这里采用斜面培养法来检查。 具体方法如下： 500ml 三角瓶内装斜面培养基 50m1，其组成为麦芽糖 6％、豆粕水解液 6％、Na2HPO412H2O ％、 (NH4)2SO40. 4％、 CaCl2 ％、 NH4C1 ％， pH ～ ，接种后置旋转式摇床亡， (37177。 1)℃ 下培养 28h左右备用。 发酵过程的工艺控制 1） 发酵过程的补料策略 中间补料是在发酵过程中补充某些营养物料、水或产酶促进剂，以满足微生物的代谢活动和产酶的需要。 α 淀粉酶生产中 要 经常补料，用 3倍年度浓度碳源的培养基补料，体积相当基础料的 1/2，从培养 12h开始，每小时 1次，分 30余次补加完毕。 延长了发酵时间，提高了酶活力和 单罐产量。 2） 发酵过程 pH 值的控制 各种微生物需要在一定的 pH环境中方能正常生长繁殖。 培养基中 C/N比值高，发酵液倾向于酸性， pH偏低； C/N比值低，发酵液倾向于中性或碱性， pH偏高。 α 淀粉酶最适 pH为 ～。 因此，在发酵过程中，可通过添加适量的尿素或碳酸钙等来调节 pH上升或下降。 武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 7 3） 发酵过程温度的控制 温度对微生物的生长、产物的合成和代谢调节有重要作用。 温度变化一方面影响各种酶反应的速率和蛋白的性质，另一方面影响发酵液的物理性质。 不同的菌种有着不同的最适温度。 枯草杆菌发酵温度控制在 35℃ ～ 37℃ 最适宜。 4） 溶氧的控制 α 淀粉酶发酵是需氧发酵，无论是基质的氧化，菌体的生长还是产物的合成均需大量的氧气。 若发酵液中氧气不足，可通过加大通气量，适当降低温度，提高罐压，补水，提高搅拌速度来控制。 α 淀粉酶发酵过程中， 0～ 12 h通气量为 1： vvm， 12 h至发酵结束通气量为 1：（ ～ ） vvm 搅拌转速 200r/min。 罐压。 5） 染菌的控制 在工业发酵中，染菌轻则影响产品的质和量 、 重则倒罐或停产 、 影响工厂效益。 因此要严格无菌操作，种子灭菌要彻底，净化空 气设备，操作要慎重，设备灭菌要彻底。 若在前期染菌，应重新灭菌；中期染菌，应偏离杂菌生长条件；后期染菌，可提前或及时放罐。 可能出现的异常发酵现象： ：可能是噬菌体污染或营养成分缺乏； ：会抑制微生物的生长，考虑可能是污水污染； ：可能原因是种子生长能力降低，检测种子是否衰退，发酵条件是否合适，以及营养成分是否全面，尤其注意缺磷； ： 用缓冲对来调节，检查是否染杂菌，碳氮比是否合适； ：最可能的原因就是营养成分不足。 下游加工 下游加工过程是生物工程的一个组成部分，是生物化工产品通过微生物发酵过程、酶反应过程或动植物细胞大量培养获得，以上述发酵、反应液或培养液分离 、 精制有关产品的过程。 下游加工过程的一般工艺流程为： 固体 → 细胞破碎 → 分离 发酵液 → 预处理 → 固液分离 液体 → 初步纯化 → 高度纯化 → 成品加工 1） 发酵液的过滤和预处理 预处理就是除去高价离子和蛋白质，对高价离子的去除可以采用草酸或磷酸，草酸它与钙离子生成的草 酸钙，还能促使蛋白质沉淀，加磷酸既能降低钙离子也能降低镁离子。 对于蛋白质的沉淀可以加入絮凝剂，调节 pH 值或加热。 过滤：采用鼓式真空过滤器，过滤前加去乳化剂并降温。 2） 提取 α 淀粉酶常用的提取方法有：盐析法、乙醇淀粉吸附法和喷雾干燥法，这里用盐析法。 具体方法：发酵液经热处理，冷却到 40℃ ，加入硅藻土为助滤剂过滤。 滤饼 加 倍水洗涤，洗液同发酵液合并后，在 45℃ 真空浓缩数倍后，加 (NH4)2SO4 至 40%饱和度。 盐析沉淀武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 8 物加硅藻土后过滤，滤饼于 40℃ 烘干磨粉即成粗酶制品。 由酶液到粉状制酶剂的收率为 70%。 成品固体酶制剂的干燥方法有烘房、气流干燥、喷雾干燥、沸腾干燥、振动干燥和真空冷冻干燥。 由于喷雾干燥生产能力大，维修保养简单，因此生产中常采用这种方法。 3） 纯化 α 淀粉酶的纯化方法可采用凝胶过滤法，就是以特定的凝胶物质为分子筛装入层析柱，再通过分离溶液时大于凝胶孔径的分子会被排阻在胶粒外，因此它们将 “ 绕道通过 ” ；小于该孔径的分子，由于可以自由出入胶粒内外，因此将沿着胶粒缝隙而直接流出。 通过一段程度的凝胶层析柱后，大小分子将依次先后流出。 枯草芽孢杆菌生产发酵 α 淀粉酶工艺总流程图 孢子斜面 ↓ 孢子悬浮液 ↓ 种子罐 ↓ 发酵罐 ↓ 补料罐 ↓ ↓ 热处理 粗滤 ↓ 盐析 ↓ 压滤 ↓ ↓ 干 燥 喷雾干燥 ↓ 粉碎 ↓ ← 填充剂 混粉 ← 包装 武汉纺织大学 年产 1000 吨淀粉酶生产工艺设计 9 4 工艺计算 工艺技术。