葡萄wrky13参与对植株生长调控及对aba的应答毕业论文(编辑修改稿)

葡萄wrky13参与对植株生长调控及对aba的应答毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

0、 1 2 34 60、 7 84 和 108h 的种子的萌发率。 取同时期收获的经过在 4℃ 条件下处理 24d 打破休眠的野生型和过表达种子，点种于无菌 1/2MS，光照培养箱 (22 ℃ ， 14 h/10 h 光周期 ) 垂直生长约 3 d，挑选生长一致的幼苗，移到含有不同 ABA 浓度（ 0、 5 和 10μmol/L）无菌 1/2MS 固体培养基，光照培养箱 (22 ℃ ， 14 h/10 h 光周期 ) 垂直生长 10d，每天记录拟南芥的侧根数量主根长度。 每个试验重复 3 次，每次试验设置三个重复。 培养基的配置 MS 培养基： g/L，蔗糖 30 g/L，琼脂 1 %， pH ， 121℃ 高压灭菌 20min，后倒平板。 LB 液体培养基：胰蛋白胨 10 g/L，酵母提取物 5 g/L， NaCl 10 g/L， pH ， 灭菌锅中 121℃ 高压灭菌 20 min。 YEB 液体培养基：胰蛋白 胨 10 g/L，酵母提取物 1 g/L，蔗糖 5 g/L， MgSO47H2O g/L， pH ，装 瓶 后 在灭菌锅中 121℃ 高压灭菌 20 min。 基上，铺板 ， 37 ℃ 倒置培养 10~16 h后观察结果。 重组质粒的鉴定 提取质粒 ： 使用质粒小量抽提试剂 回收目的条带 （参见 Takara 试剂盒说明书） PCR 鉴定：以质粒 DNA 为模板，按相应的 PCR 体系与程序进行 PCR 鉴定，以无菌 ddH2O 为模板作为阴性对照。 酶切鉴定：取质粒 DNA 4 μL加入相应的限制性内切酶各 μL和 2 μL缓冲液，在 20 μL的反应体系中于 37 ℃ 酶切反应 30min，电泳检测酶切效果。 8 根癌农杆菌 （ GV3101） 感受态细胞的制备及转化 活化 80℃ 超低温保存 根癌农杆菌（ GV3101）接种于 3 mL YEB液体培养基中（含50mg/L Rif）， 28 ℃ 振荡培养箱中 振荡培养过夜。 活化后取 500 μL菌液加入到 50 mLYEB液体培养基中， 28 ℃ 振荡培养箱中 振荡至 OD600为 （ 4 ℃ ， 5000 rpm） 离心 5 min，收集菌体， 放于 10 mL预冷的 mol/L NaCl溶液悬浮，冰浴片刻， 4 ℃ ， 5000 rpm离心5 min。 取 1 mL预冷的 20 mmol/L CaCl2重悬菌体，分装成每管 200 μL，液氮中速冻 1 min，置 80 ℃ 保存备用。 花芽浸蘸法转化拟南芥及阳性植株的筛选 正常条件下培养的拟南芥，在抽薹 45 cm时剪去顶端花序，使腋生花序生长，约 45 d后进行转化，转化前去除已经开放及露白的花蕾，同时剪去角果。 将拟南芥整株与花盆一起倒扣在菌液中浸苗 35 min，转化完毕后取出花盆，侧放于托盘中，避光培养 24 h后，直立放置 花盆，进行正常的光照培养。 收取已成熟的 T1代种子，点播在含 50 mg/L Hyg的 MS培养基中， 4 ℃ 处理 3 d后移入光照培养箱。 810 d后挑选转化体，将苗移入土中培养，以收获 T2代种子。 将 T2代种子继续种于含有 Hyg的 MS选择培养基上，选择接近 3:1分离群体的抗性植株，种植收获 T3。 若 T3代种子在选择性培养基中全部具抗性，则对应的 T3代种子便是纯合体。 提取其叶片RNA，用基因的特异引物进行 RTPCR检测。 气孔开度测定 取生长良好的 45周龄拟南芥植株完全展开的莲座叶，光下（光强 200μ mol/m2/s）60 min 诱导气孔张开。 取 叶片 下表皮， 去除 叶肉细胞 ， 放置于含有 ABA处理的 MES溶液中，在光下（光强 200μ mol/m2/s）处理 60 min，放置于显微镜下， 随机取 3个视野测量，再在每个视野中随机选取 10个气孔， 用显微测微尺测量记录气孔孔径。 实时定量 PCR CTAB 法提取处理后的葡萄总 RNA， MMLV 反转录试剂盒合成 cDNA 第一条链作为模板。 Realtime PCR 程序为： 95 ℃ 60 sec， 95 ℃ 10 sec， 56 ℃ 20 sec， 72 ℃ 15 sec，40 个循环； Melt 曲线从 72 ℃ 至 99 ℃ ，第 1 步维持 45 sec，以后每升高 1 ℃ 维持 5 sec。 每个样品进行 3 次重复。 以 ACTIN 为内参对基因进行相对定量， Realtime PCR 引物。 定量实验所用引物如表 1 所示。 9 表 1 Realtime PCR 引物 基因名称 引物序列 VvWRKY13 FP: CGACTCGTTTCTTTACGC RP: AGTGAGGTGGATGTTCTTG Vvactin FP: AATGAGAGATGGCTGGAAGAG RP: TACGAGCAAGAGCTGGAAA AtABA1 FP: TATGAAGGTGATCTGCTTGTGG RP: CGTGTAACAAGTGTAGCCTGA AtABA2 FP: TGGAGGAGCCACAGGGATA RP: TTGGACTCACCACGAAGCA AtABI1 FP: GCCTTTGTATGGTTTTACTTCG RP: GGATCAAACCGACCATCTAAC AtABI3 FP: AGCCAGAGTTCCTTCCTTTA RP: TTGGTACGGATTCATGTTGT 2 结果与分析 葡 萄 WKRY13 的异源表达植株的获得 pSuper1300WRKY13 重组质粒的构建 pSuper1300WRKY13 重组质粒的菌落 PCR 鉴定 将双酶切得到的 WRKY13 片段回收 ， 分别与同样双酶切回收的 Super1300 载体连接转入大肠杆菌 DH5α 中 ， 挑取单菌落 PCR 鉴定。 结果显示，扩增得到大小约 700 bp 左右的片段（图 1），说明样品中包含带有目的片段 WRKY13 的重组质粒。 图 1 pSuper1300WRKY13 重组质粒的菌落 PCR 鉴定 of PCR products of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13 注： M： DL 2020 DNA Marker； S1 和 S2：两个样品 bp 2020 1000 750 500 250 100 S1 S2 M 10 pSuper1300WRKY13 重组质粒的酶切鉴定 选取阳性克隆，提取质粒，经 XbaⅠ 和 KpnⅠ 双酶切鉴定， 片段大小一致，测序正确 （ 图 2）。 pSuper1300WKRY13 重组质粒转入农杆菌菌落 PCR 鉴定 将正确的 pSuper1300WKRY13 重组质粒 转化农杆菌 GV3101， 挑取单菌落，进行PCR 鉴定，显示 片段大小正确（图 3），说明菌落包含重组质粒的农杆菌。 图 2 pSuper1300WRKY13 重组质粒酶切 鉴定 Analysis restriction digestion analysis of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13 注： M： DL 2020 DNA Marker； S1 和 S2：两个样品 bp 2020 1000 750 500 250 100 S1 M bp 2020 1000 750 500 250 100 S1 M S2 图 3 pSuper1300WRKY13 重组质粒转农杆菌 GV3101 菌落 PCR 鉴定 of PCR products of rebinant plasmids of pSuper1300WRKY13 注： M： DL 2020 DNA Marker； S1 和 S2：两个样品 11 转基因植株的筛选 利用 花芽浸蘸法转化拟南芥 ， 收获 T0 代种子，用 50 mg/L 的 Hyp 对转基因拟南芥种子进行筛选，观测转基因植株在抗性 MS 培养基上的生长情况（图 4），挑选生长状态良好，根系发达的幼苗移苗培养，进行后续鉴定。 转基因植株的 PCR 鉴定 抗性培养基上生长良好的拟南芥幼苗，移植在营养土中进行培养，提取四周龄植株叶片的中 DNA，进行 PCR 鉴定，结果显示 大小正确，条带单一 （ 图 5）。 结果表明获得 WRKY13 基因的异源过表达拟南芥植株。 转基因植株的 WRKY13 基因相对表达量 图 4 转基因植株在抗性 MS 培养基上的生长情况 The growth of transgenic plants on MSHyp M bp 2020 1000 750 500 250 100 图 5 转基因 过表达 拟南芥抗性植株 PCR 鉴定 Analysis of PCR products of transgenic plants 注： M： DL 2020 DNA Marker； S：多个个样品 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 S11 12 gfedcba020406080100120140160180200WTOEWR13AOEWR13BOEWR13COEWR13DOEWR13EOEWR13FWRKY13相对表达量WRKY13 relative expression 利用实时定量 PCR 技术对转基因植株不同的株系中的 WRKY13 的表达量进行了检测，从图 6 得知， 转基因植株中 各个株系均有不同程度的 过量 表达 ，但不同的株系之间基因的表达量差异明显，选择了 OEWR13A 和 OEWR13B 两个 过表达 株系进行后续实验 葡萄 WRKY13 异源表达植株生长的变化 葡萄 WRKY13 异源表达植株的种子萌发速率 0204060801001200 6 12 24 36 48 60 72 84 108生长时间 /h T i m e /h萌发率Germination（%）WT O E W R 1 3 A O E W R 1 3 B 由 图 7 得 知，虽 在 60 h 时 野生型和异源表达种子都全部萌发，但 WRKY13 异源表达植株种子的萌发时间延迟， 野生型 萌发的最早时期是 6 h，而过表达株系 萌发的最早时期 是 12h； 在第 36 h 时 野生型 和过表达 的萌发率 差异最显著 ， 推测葡萄 WRKY13 延缓图 6 转基因植株 WRKY13 的基因相对表达量 Quantitative RT–PCR analysis of WRKY13 expression of transgenic plants abc02040608010012036h萌发率Germination(%。