红霉素产生菌的筛选与鉴定生物技术毕业论文(编辑修改稿)

红霉素产生菌的筛选与鉴定生物技术毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

ZnSO4： 国药集团化学试剂 有限公司 ，分析纯； NaCl：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； NaOH：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； CuSO4： 国药集团化学试剂有限公司 ，分析纯； Cu2O：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； KMnO4：北京益利精细化学品有限公司，分析纯； KI：北京奥博星生物技术责任有限公司，分析纯。 试验仪器 试管，移液管，培养皿，玻璃棒，烧杯，锥形瓶，量筒，碱式滴定管，酸式滴定管，胶头滴管，蒸发皿，石棉网，小漏斗，试管架，试管夹 ，漏斗，漏斗架 ； 电子天平 (FA2104；上海恒平科学仪器有限公司 )； 分光光度计 (VIS7220N；北京瑞利分析仪器公司 )； 电热恒温水浴锅 (GSY10；北京市医疗设备厂 )； 台式高速离心机 (TGL20；武汉中科仪器发展有限公司 )； 旋转蒸发器 (RE5299；上海亚荣生化仪器厂 )； 索氏提取器 (SXT02；上海洪纪仪器设备有限公司 )； 6 凯式定氮装置 (SBD100；北京市通润源机电技术 有限公司 )； 调温电炉 (SXL1200；上海大恒光学精密机械有限公司 )； 酸度计 (MP9000；上海大恒光学精密机械有限公司 )； 水浴锅 (DZKW)， 100 mL 三角瓶 ， 10 mL 刻度吸管， 25 mL 刻度吸管，酸式滴定管， 100 mL 容量瓶， 250 mL 锥形瓶， 大试管： 9 支，容量瓶： 50 mL2 ，刻度吸管： 1 mL3 ， 2 mL1 ，5 mL1。 试验方法 红霉素发酵属于好氧发酵过程，在发酵过程中，需不断通入无菌空气并搅拌，以维持一定的罐压和溶氧。 发酵过程中应严格控制发酵温度、发酵液还原糖量、 pH 值、溶氧量及发酵液粘度等，以便红色糖多孢菌能够大量合成红霉素并排至胞外。 生产中还要加入消泡剂以控制泡沫。 在发酵期间每隔一定时间也要取样进行分析、镜检及无菌试验，检测生产状况，分析或控制相关参数。 发酵液的预处理和过滤 发酵液中除含有约 %的红霉素外，绝大部分是菌丝体、蛋白质、色素、油等杂质，会给提取和精制带来很大的困难。 尤以蛋白质和油等的存在，在溶媒萃取时将产生严重的乳化现象。 一般采用硫酸锌沉淀蛋白质，目的是使菌丝结成团加快过滤速度。 因为硫酸锌呈酸性，为了防止红霉素局部酸解而被破坏，我们一般要 用 NaoH 来调节 pH 值。 在处理滤渣时也会遇到一些问题，因为锌离子是有毒性的，所以我们改用碱式氯化铝处理滤渣。 经过预处理的发酵液便可进行过滤去除菌丝体及沉淀的蛋白质。 红霉素发酵液过滤采用板框过滤机。 红霉素的提取 红霉素分子结构中有一个二甲基氨基官能团，是一个弱碱，在酸性条件下与某些酸会形成盐，如红霉素乳酸盐。 如果是纯红霉素碱那么在水中溶解度较小，并且会随温度升高而减小，在 55℃时溶解度最小，当 pH＞ 时红霉素基本以游离碱的形式存在，能溶于乙酸丁酯中，当 pH＜ 时，红霉素以盐的形式存在，其 在水中的溶解度随 pH 降低而迅速增大。 提取方法是在乙酸丁酯及水溶液（乙酸缓冲液）中反复萃取。 发酵方法 A．摇瓶培养 用种子培养冷冻管取红霉素菌种接种于 30 度母斜面上，养 7d 接种于 30 度子斜面继续培养， 7d 后接种于一级种子瓶。 30000r/min 培养 4856h 转入二级种子瓶 30000r/min 继 7 续培养 2630h，发酵培养将上培养好的二级种子接种于发酵瓶， 30000r/min 培养 16h。 摇瓶装液量为 50ml/250ml，每组结果均为 5只摇瓶的平均效价。 B．发酵罐培养 种子培养的步骤与摇瓶培养相同，发酵培养就是将上面培养好的二级种子接种于 3L发酵罐自动发酵，同时控制发酵罐的发酵温度、 PH、 接种量、搅拌速度和溶解氧等条件，培养 16h。 8 第三章 试验结果 选因素、定水平 （ 1）仅超声波诱变法定水平 分别取 10ml 出发菌株的菌悬液于 30 支 25ml 的试管中，放入超声波清洗器中，水淹没至试管 2/3 左右，进行超声波处理。 超声波功率分别为 200W、 300W、400W，诱变时间分别为 0min、 3min、 6min、 9min、 12min、 15min、 18min、 2min、24min、 27min、 30min。 根据实验结果可以发现：随着超声波诱变时间的增长，红色糖多胞菌的致死率都在不断的增加；在 3 个不同功率的超声波诱变中，超声波功率为 200w 时，随着诱变时间的增长，致死率上升得不明显，诱变效果不显著；超声波功率为400ｗ时，红色糖多胞菌很快就全部致死，反而没有达到诱变效果；超声波功率为 300ｗ时，诱变时间 20min，致死率接近 83%，且平板上的红色糖多胞菌菌落大小不均一，诱变效果较好。 （ 2）仅 LiCl 诱变法定水平 Licl 诱变法定水平的实验采用两种方法：一是在培养基中加入不同浓度的氯化锂；二是用不同浓度的氯化锂处理孢子后在培养。 根据菌株致死率来判断诱变效果。 根据实验结果：第一种方法能取得比较好的致死效果，可能是因为在培养的过程中，培养基中始终有氯化锂存在，对红色糖多胞菌起着长期诱变的作用，因此诱变效果更好。 随着氯化锂浓度的提高，致死率也随着提高，当氯化锂浓度超过 %时，红色糖多胞菌的致死率增加幅度不在显著，因此在诱变 中氯化锂浓度确定为 %。 在正交实验中，氯化锂浓度分别选 %、 %、 %三个水平，并分别采用两种方法进行实验。 根据实验具体情况选定的因素及其水平： 因素 A：超声波功率（ W） 水平： 200W 300W 400W 因素 B:诱变时间（ min） 9 水平： 10min 20min 30min 因素 C:LiCl 浓度（ %） 水平： 因素 D： LiCl 使用方法 水平： 培养基中加入 LiCl 孢子悬浮液里 4h 同时处理 可以确定此实验为四因素、三水平实验，可以选择正交表 L9(34) 项目 1 2 3 4 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 表头设计 水平 A、 超声波功率 （ W） B、诱变时间 （ min） C、 Licl 浓度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培养基中加 Licl 2 300 20 孢子悬浮液处理 3 400 30 同时处理 顶行：实验考虑的因素 最左列：实验进行的次数，每一列代表试验中安排的各个因素的水平 实验方案及其实验结果 水平 A、超声波功率 （ W） B、诱变时间 （ min） C、 Licl 浓度 （ %） D、 Licl 使用方法 1 200 10 培养基中加 Licl 2 300 20 孢子悬浮液处理 3 400 30 同时处理 10 试验号 A B C D 生物效价（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 试验号 A B C D 生物效价（ ug） 1 1 1 1 1 4410 2 1 2 2 2 4464 3 1 3 3 3 3221 4 2 1 2 3 3100 5 2 2 3 1 4702 6 2 3 1 2 4649 7 3 1 3 2 3321 8 3 2 1 3 3617 9 3 3 2 1 3867 K1 4032 3610 4225 4326 35351 K2 4150 4261 3810 4145 K3 3602 3912 3748 3313 R 548 651 477 1013 11 （ 1）实验结果中重要数据的计算方法： K1即第 j列上水平号为 1的各实验结果之和的平均值 K2 即第 j列上水平号为 2 的各实验结果之和的平均值 K3 即第 j列上水平号为 3 的各实验结果之和的平均值 R 即第 j列的极差或其所在因素的极差 （ 2）计算公式： Rj=MAX{Kj}MIN{kj} R 值（极差）的作用，一般来说，各列的 R 值（极差）是不相等的，这说明各因素改变时对实验结果的影响是不相同的。 极差越大，说明这个因素的水平的改变对实验结果的影响越大。 极差最大的那一列的因素，就是因素的水平改变对实验结果影响最大的因素，也就是最主要的因素。 本题中： DBAC,即因素的影响程度为：氯化锂使用方法＞超声波诱变时间 ＞超声波功率＞氯化锂浓度。 (3)。