红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚psy基因的分离毕业论文(编辑修改稿)

红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚psy基因的分离毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

LB 培养基进行培养，提取质粒 ，链接产物。 序列测定 鉴定 后的 克隆 送至 上海英俊生物技术有限公司测序，测序结果提交到 NCBI 中核 酸数据库做 BLAST 同源性检索，并利用 Clustal X 软件对所得序列进行 分析。 4 结果与分析 RNA 电泳结果分析 RNA 样品的凝胶电泳分析是判断 RNA 质量的一种重要手段，从电泳胶上 28S rRNA 和 18S rRNA 的完整性可以判断 RNA 有无降解及降解程度，也可以判断有无DNA 污染。 正文： 红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚 PSY 基因的分离 9 采用改良 Bugos 法提取红肉蜜柚突变体及其亲本琯溪蜜柚果实总 RNA，色泽白，较为透明，易于溶解。 样品经电泳检测表明，提取出总 RNA 能清楚地看到 28S rRNA 和 18S rRNA 两条 RNA 条带，提取的 RNA 完整，没有发生降解。 图 11 果肉 RNA 琼脂糖凝胶电泳图谱 注： 1. 红肉蜜柚； 2. 琯溪 蜜柚 RNA 紫外分光光度计测定结果分析 一般情况下，紫外测定结果 OD260/OD280比值为 ， OD260/OD230比值大于 时认为获得的 RNA 样品较纯净。 当 OD260/OD280比值小于 时，可能有蛋白 表 15 总 RNA 比色测定结果 紫外比色及比值 样品名称 红肉蜜柚 琯溪蜜柚 RNA 的含量 ng/μL ng/μL OD260/OD280 OD260/OD230 质污染； OD260/OD230比值小于 时， RNA 样品可能还有其它如酚类化合物的干扰物存在 [12]。 从表 15 测定结果可以看出， OD260/OD230的吸光度比值大于 ，说明没有多糖、盐或其他杂质的重大污染。 OD260/OD280处的吸光度比值接近 ，说明也没有蛋白质的重大污染，故用此法所提总 RNA 纯度较好，所以进行后续试验。 纯化后的 RNA 电泳结果分析 采用改良 Bugos 法提取所得 RNA 存在一定的 DNA 污染，因而应用这些样品进行 RTPCR 或其它操作前应先用 Dnase 去除 DNA，或对本方法所得 RNA 进行再次 LiCl 沉淀以进一步去除 DNA。 从图 12 来看，提取的样品已无 DNA 的污染。 1 2 1 2 正文： 红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚 PSY 基因的分离 10 图 12 果肉 RNA 纯化后的电泳图谱 注： 1. 红肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚 合成的 cDNA 电泳结果分析 从图 13 来看，合成的 cDNA 二链呈弥散状， 在 500~750 bp 间有特征带的出现，表明该物种果实中大部分基因的长度都在该区间内。 图 13 cDNA 二链电泳图谱 注： M. marker； 1. 红肉蜜柚； 2. 琯溪蜜柚； 3. 阴性对照 PSY 基因的克隆 琯溪蜜柚与 红肉蜜柚 PSY PCR 结果显示，两者扩增片段大小相同，均扩增出单一的条带，大约为 1300 bp， 将片段回收，连接至 T载体，转化至大肠杆菌 DH5α，经实验室初步验证正确后送上海英杰公司测序。 序列性分析 将测序结果整理如下（方框内为 PCR 扩增 时 所使用引物），测序结果表明，红肉蜜柚和琯溪蜜柚 PSYcDNA 均长 1317 bp， 与 NCBI 网站上其他相似序列比对结果发现，该 DNA 序列 包含完整的阅读框，编码 423 个氨基酸。 （ 1） 红肉蜜柚果实 PSY 基因全序列（红肉蜜柚 PSY 基因进行了两次测序，测序结果完全一 致）： ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGT 1 2 M 1 2 3 1300bp—— 正文： 红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚 PSY 基因的分离 11 TCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGGCTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTAATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGGAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACAGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAGGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTTTATCTACCACAAGATGAGTTGGCATAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACCTCATGAAGAACCAAATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAGGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 将测序结果在 NCBI 网站比对，结果如表 16。 表 16 红肉蜜柚果实 PSY 基因测序结果比对 Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2448 2448 100% 99% gi|82394886| Citrus sinensis phytoene synthase mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|6959859| Citrus unshiu phytoene synthase (Psy1) mRNA, plete cds 2402 2402 100% 98% gi|11344506| Citrus unshiu mRNA for phytoene synthase, plete cds 2402 2402 100% 98% 续表 16 gi|166343815| X Citrofortunella mitis phytoene synthase mRNA, plete cds 2390 2390 100% 98% gi|13542331| Citrus x paradisi phytoene synthase mRNA, plete cds 2384 2384 100% 98% 注： Citrus maxima：文旦； Citrus sinensis：甜橙； Citrus unshiu：温州蜜柑； Citrofortunella mitis：正文： 红肉蜜柚及其亲本琯溪蜜柚 PSY 基因的分离 12 四季橘； Citrus paradisi：葡萄柚 通过比对结果发现： ① 红肉蜜柚果实 PSY 基因与柑桔属 PSY 基因同源性都相对较高，其中与柚 PSY 基因（ No. 166343817） 同源性最高； ② 与柚 PSY 基因（ No. 166343817）比对发现：有一个 TAA 的 gap 存在； 9 个碱基不匹配。 （ 2） 野生型琯溪蜜柚 PSY 基因全序列 ATGTCTGTTACATTGCTGTGGGTTGTATCACCTAACTCACAATTGTCCAATTGCTTCGGGTTCGTCGATTCAGTTCGAGAGGAAAACAGGCTGTTTTATTCATCAAGATTTCTTTACCAACATCAAACCCGGACTGCTGTGTTTAATTCTAGACCTAAGCAGTTTAATAATAATAATAATAATAAGCAGAAACGGAATTCTTATCCTTTAGATACAGATTTGAGGCATCCTTGCTCATCTGGAATCGACTTGCCTGAAATATCATGTATGGTTGCTAGCACTGCTGGAGAAGTGGCCATGTCTTCAGAAGAAATGGTTTACAATGTTGTGCTCAAGCAGGCAGCCTTGGTTGATAAGCAACCAAGTGGGGTTACTCGTGATCTTGATGTGAACCCAGATATTGCTTTACCCGGAACTTTAAGTCTGCTCAGTGAAGCTTATGATCGTTGTGGAGAAGTTTGCGCCGAGTATGCTAAGACATTTTACTTGGGAACTTTGCTGATGACCCCTGAAAGGCGAAGGGCTATATGGGCTATATATGTGTGGTGTAGGAGGACAGATGAGCTCGTTGATGGGCCTAATGCTTCACACATAACTCCAACAGCTTTAGACGGGTGGGAGTCCAGGTTGGAAGACCTTTTCCGGGGTCGTCCATTTGATATGCTTGATGCTGGATTATCAGATACAGTAACCAAATTTCCTGTCGACATTCAGCCATTCAGAGATATGATAGAAGGAATGAGGATGGACCTTAGGAAGTCAAGATACAAAAACTTTGATGAATTATACTTGTATTGTTATTATGTTGCTGGGACCGTAGGGCTAATGAGTGTTCCAGTTATGGGCATAGCACCTGACTCACAGGCAACAACAGAGAGCGTCTACAATGCAGCATTGGCACTAAGGATTGCTAATCAGCTCACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAGGATGCCCAAAGAGGAAGGGTATATCTGCCACAAGATGAGTTGGCACAGGCGGGGCTTTCAGATGATGACATATTTGCTGGAGAAGTGACTAATAAATGGAGAAACTTCATGAAGAACCAGATTAAGAGGGCAAGGATGTTCTTTGATATGGCTGAGAACGGTGTGACCGAGCTGAGTGAAGCTAGTAGATGGCCGGTATGGGCTTCATTGCTGTTGTACCGGCAAATACTGGATGAGATTGAGGCCAATGATTACAACAACTTCACAAAGAGAGCTTATGTGAGTAAAGCCAAGAAGATAGCTGCACTACCAATTGCATATGCAAAATCCCTCTTACGCCCGTCAAGAATATATACCAGTAAGGCTTAA 将测序结果在 NCBI 网站比对，结果如表 17。 表 17 琯溪蜜柚果实 PSY 基因测序结果比对 Accession Description Max score Total score Query coverage Maxident gi|166343817| Citrus maxima phytoene synthase mRNA, plete cds 2442 2442 100% 98% 正文：。