果蝇精巢fasⅲ基因原核表达载体的构建毕业论文(编辑修改稿)

果蝇精巢fasⅲ基因原核表达载体的构建毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

琼脂糖凝胶电泳检测 （ 1）制备 ％琼脂糖凝胶：称取 琼脂糖，加入 25ml1 TAE 缓冲液，置微波炉加热 至完全融化，取出摇匀。 （ 2）胶板的制备： 1） 将塑料内槽洗净、晾干，放置于水平制胶器中，并放好样品梳； 2） 待胶液冷到 60℃左右时，加入 2— 3μ l 的溴化乙锭，轻轻混匀后将胶液倒入塑料内槽，至塑料板上形成一层胶面； 3） 待胶液凝固后，将梳子轻轻垂直拔出； 4） 将塑料内槽取出放入电泳槽内，并加入 1 TAE 缓冲液至电泳槽中使缓冲液浸没胶面，高出凝胶。 （ 3）加样：取约 2μ l10 loading buffer 与 2μ l PCR 产物混合均匀，用移液枪加到凝胶孔中，并用 DL15000TM DNA Maker 做对照。 （ 4）电泳：盖好 电泳槽盖子，接通电泳槽与电泳仪的电源，选择电泳电压 120V，开始电泳。 （ 5）观察结果：取出样品，在紫外灯下观察，摄像，根据片段大小判断目的片段是否扩增成功。 酶切 DNA 产物的纯化 产物共 150μ L，集中到 EP 管，加无菌水至 500μ L （ 1）酚抽：在 EP 管中加入等体积，即 500μ L 苯酚 /氯仿混合液，颠倒混匀，室温 12020r/min 离心 5min，吸取上层液到新的 EP 管，吸约 450μ L （ 2）加入 1/10 体积的 5M NaCl（按 450uL 换算，即 45μ L NaCl） 13 （ 3）加入 23 倍体积无水乙醇 1mL，混匀， 4℃ 12020r/min 离心 10min，吸走上清液，产物沉淀在底部。 （ 4）漂洗：用 70%乙醇清洗沉淀 12 次，离心，彻底吸走上清液。 （ 5）干燥和溶解：自然干燥 5min 至残留乙醇挥发干净，加入 20μ L 无菌水溶解。 酶切，体系如表 所示 表 酶切体系 50μ l Table Enzyme digestion system(50μ l) 反应组分 体积 无菌水 l BSA l 10 l BamHI l HindⅢ l 质粒或片段 l 溶液配好混匀后瞬时离心，使溶液集中于管底，放在 37℃ 水浴锅水浴 1h；其中PET28a 质粒酶切管在水浴 1h 后需加入 1μ lCIAP，接着水浴 30min。 琼脂糖凝胶电泳法回收 DNA 制胶 切胶 琼脂糖凝胶 DNA 回收试剂盒 操作步骤 （ 1）柱平衡步骤：向吸附柱 CA2 中加入 500μ l 平衡液 BL， 12020rpm 离心 1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 2）将单一的目的 DNA 条带从琼脂糖凝胶中切下，放入干 净的离心管中，称取重量。 （ 3）向胶块中加入 3 倍体积溶胶液 PN， 50℃水浴放置 10min，其间不断温和地上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。 （ 4）将上一步所得的溶液加入一个吸附柱 CA2 中，室温放置 2min， 12020rpm离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中。 （ 5）将吸附柱 CA2 中加入 600μ l 漂洗液 PW， 12020rpm 离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CA2 放入收集管中。 （ 6）重复操作步骤 5 （ 7）将吸附柱 CA2 放入收集管中， 12020rpm 离心 2min，尽量除 尽漂洗液。 将吸附柱 CA2 置于室温放置数分钟，彻底晾干。 （ 8）将吸附柱 CA2 放到一个干净的离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加适量 14 洗脱缓冲液 EB，室温放置 2min。 12020rpm 离心 2min 收集 DNA 溶液。 （ 9）电泳检测：分别取 3μ l 酶切样品与 2μ l 10 loading buffer 混合后加到凝胶孔中开始电泳，电泳结束后取出样品，在紫外灯下观察，摄像。 DNA 片段的体外连接 (目的基因导入质粒载体 ) 配制连接体系，各成分如表 所示，体系中外源基因量要多些，载体的量要少些； 表 连接体系 10μ l Table Connection system(10μ l) 反应组分 体积 10 T4 DNA ligase Buffer l T4 DNA ligase l 酶切的 PET28a 质粒 l 酶切的 fasⅢ片段 l 混匀后用瞬时离心，使液体全部集中于管底； 将离心管放于 16℃ 水浴锅保温过夜； 取出连接体系，利用感受态细胞进行转化实验。 连接体系的转化 取 1 管 100μ l 的 TOP10 超级感受态细胞 ，在冰上化冻后，在无菌操作台里向EP 管中加入 7μ l 连接体系，用枪轻轻吹打混匀； 将 EP 管插在冰水复合物中冰浴 30min； 将 EP 管放到 42℃恒温水浴锅中保温 90s，然后迅速放到冰水复合物中冰浴2min； 在无菌操作台里向 EP 管中加入 1ml 的含 K 的液体 LB 培养液，混匀后放于摇床上 37℃振荡培养 45min，转速为 150rpm/min，使细胞恢复正常生长状态； 45min 之后， 3000r/min 离心 3min 在无菌操作台中弃去 950μ l 上清液，余下的 150μ l 用移液枪轻轻打匀，吸至含 K 的 LB 培养基平板中，用事先已 经加热灭菌并冷却后的三角推棒轻轻涂布均匀； 待涂布液干燥后，将平板 37℃培养箱中倒置过夜培养。 挑菌落做菌落 PCR PCR 反应体系 表 PCR 反应体系 25μ l Table PCR reaction system(25μ l) 反应组分 体积 10PCR Buffer l 15 dNTP l 上游引物 fasⅢ bamH/F l 下游引物 fasⅢ Hind/R l rTaq 酶 l 模板 ddH2O l 模板：阳性对照 — 重组质粒的连接体系 阴性对照 — 无菌水 实验组 — 待检测的菌落 PCR 反应程序 97℃ 3min 94℃ 30s 30 cycles 52℃ 30s 72℃ 1min 72℃ 3min 16℃ 3min 琼脂糖凝胶电泳检测：以 DNA Mamker 和阳性对照作参考，判断实验组条带大小是否正确，进而判断是否为阳性克隆。 重组质粒的转管培养 经过菌落 PCR 鉴定后，挑选 4 个初步鉴定是阳性克隆的菌落转管培养。 将无菌操作台灭菌后，取 4 个 15mlEP 管，分别加入约 4ml 含卡那霉素（ Kan）的 LB 液体培养基。 用无菌枪头挑取单菌落，在 EP 管的培养基中轻轻搅拌，并将枪头打入 EP 管中，盖紧管盖，放于摇床上 37℃振荡培养过夜，转速为 180rpm/min。 PET28afasⅢ质粒的少量制备 菌液保种：将选取的菌液扩大培养，浑 浊后分别取 450μ l 菌液并各加入 50μ lDMSO 于 20℃冻存。 用质粒小提试剂盒（离心柱型）提取并制备质粒。 操作步骤： （ 1） 柱平衡步骤：向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 平衡液 BL，倒掉收集管中的废 16 液，将吸附柱重新放回收集管中。 （ 2） 取 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 12020rpm离心 1min，尽量吸除上清。 （ 3） 向留有菌体沉淀的离心管中加入 250μ l 溶液 P1（使用前已加入 RNaseA） ,用移液枪彻底悬浮细菌沉淀。 （ 4） 向离心管中加入 250μ l 溶液 P2，温和地上下翻转 68 次使菌体充分裂解，所用时间不超过 5 分钟。 （ 5） 向离心管中加入 350μ l 溶液 P3，立即温和地上下翻转 68 次，充分混匀，将出现白色絮状沉淀。 12020rpm 离心 10min。 （ 6） 将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱 CP3 中，尽量不要吸出沉淀。 12020rpm 离心 30sec,倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放入收集管中。 （ 7） 向吸附柱 CP3 中加入 500μ l 去蛋白液 PD， 12020rpm 离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 重新放回 收集管中。 （ 8） 向吸附柱 CP3 中加入 600μ l 漂洗液 PW， 12020rpm 离心 30sec，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 CP3 放回 收集管中。 （ 9） 重复操作步骤（ 8） （ 10） 将。