酪蛋白糖巨肽(cgmp)对小鼠肠道菌群的影响毕业论文(编辑修改稿)

酪蛋白糖巨肽(cgmp)对小鼠肠道菌群的影响毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

utualism)来描述宿主和肠道微生物之间共生关系 , 这反映出人类在这方面认识不足 , 尚未意识到宿主与肠道微生物之间的密切关系 , 以及肠道微生物对维持人类健康和正常菌落稳定的巨大贡献 [5052]。 到目前为止，人们已经认识到只要胃肠道内微生物菌群处于健康的平衡状态，人类机体的健康就能够得到保障。 而一旦这些肠道内的微生物平衡遭 到破坏就可能导致人体发生疾病，甚至危及生命[29,31]。 近年来国外学者大量研究和报道了 CGMP 的相关生理功能（如：双歧杆菌增殖因子、抑制胃酸分泌、抑制病原体包括病毒和细菌等粘附至细胞、调节免疫系统应答等），其生物学功能已经等到了科学家和相关企业的关注，将在生物医药、功能食品以及专用食品的研究开发中为人类健康做出贡献。 但是国内外有关CGMP 对 肠粘膜内各类微生物区系的变化以及对 肠道中微生物菌群的调理作用方面的研究报道却很少。 因此我们需要对其调理肠道微生物的具体功能和机制作进一步的探讨。 课题研究的意 义 肠道菌群与人体外部环境保持着一个平衡状态，对人体的健康起着重要作用，但是这种平衡在某些情况下被打破，形成肠道菌群失调，从而引起多种疾病，如：炎性肠病（ IBD）、结肠癌、类风湿性关节炎、遗传过敏性皮炎、哮喘等。 近年来，随着科技的进步人们逐渐认识到肠道微生物对人类健康的重要性。 研究肠道中的基本微生态规律对纠正菌群失调、增强体质、提高健康水平、发展相应的微生态制剂具有重要的理论价值和实践意义。 近年来 许多研究 报道显示 CGMP有多种特殊的生物学活性 ，尤其是 CGMP能够促进肠道内双歧杆菌、乳酸杆菌的增 殖 ，但 国内外关 于 CGMP对小鼠肠道菌群影响的 体内试验 研究报道却很少。 综上所述，酪蛋白糖巨肽在抗菌、调节肠道免疫、促进肠道益生菌的增殖等多方面都具有独特的生物学功能，作为功能性食品方面又很好的潜力。 该研究对乳中功能性成分在维持其微生态平衡，探讨肠道中微生物菌群与人类健康的关系以及调理肠道中微生物菌群的平衡等方面将提供一定的理论依据，并为其在功能性食品、医药或其它领域的应用方面奠定坚实的理论基础。 课题研究内容 本课题主要研究以下几项内容： 技术试验条件的优化 CGMP前后小鼠肠道菌群的变化； ERICPCR指纹图谱技术 检测灌胃 CGMP前后小鼠肠道菌群 群落结构 的变化。 第二章 材料与方法 荧光原位杂交技术（ FISH）分析 CGMP 对小鼠肠道菌群的影响 实验原料 CGMP 购自新西兰 Tatua Dairy Cooperative 公司 主要化学 试剂 倒置 荧光显微镜（ Nikon，日本）；杂交缓冲液（ ， 20mMTrisHcl，pH=， %SDS， 30%（ V/V）的甲酰胺， 10%（ w/v）的硫酸葡聚糖）；漂洗缓 冲 液 （ ， 20mMTrisHcl ， pH= ）； PBS （ 130mMNacl ， ， pH=）；荧光探针（ 其中 EUB 338探针 3′末端标记 FITC 荧光染料 ， Enter143 Bif16 ENF 19 Lacb722 探针 3′末端标记 ROX 荧光染料 ， Invitrogen，美国）；多聚赖氨酸防脱玻片、 RNasefree盖玻片 (博士德生物工程有限公司 ) 表 21 16S rRNA探针序列 Table 21 16S rRNAtargeted oligonucleotide probes Probe OPDcode Probe sequence（ 5′to3′） Target anism Reference EUB 338 SDBact0338aA18 GCTGCCTCCCGTAGGAGT All Bacteria [23] Enter1432 SGEnter1432aA15 GTTTTGCAACCCACT Enterobacteriaceae [24] Bif164 SGBif0164bA18 CATCCGGYATTACCACCC Bifidobacterium [25] Lacb722 SGLacto722aA25 YCACCGCTACACATGRAGTTCCACT Lactobacillus group [26] ENF 191 SGENF191aA13 GAAAGCGCCTTTCACTCTTATGC Enterococcus faecalis [27] 注： R=G/A, Y=T/C, M=A/C, K= G/T, S= G/C, W= A/T, H=A/C/T, B=G/T/C, V=G/C/A, D=G/A/T, N=G/A/T/C. 试验动物及分组： 实验动物： 25～ 30g 健康的 BALB/c 雄性小鼠， 购自中国人民 解放军 军事医学科学 实验动物中心 ，合格证号为： 0038134。 将实验动物适应饲养一周后随机分成 2组。 其中对照组每天 早上 灌胃 ， CGMP组每天 早上 灌胃 浓度为 ， 灌胃周期为 2周。 表 22 实验动物的分组设 置 组别 试验项目 对照组 生理盐水 剂量组 试验 仪器： 表 23 实验仪器 设备清单 仪器名称与型号 生产厂家 三洋全自动灭菌锅 日本三洋公司 DS5MC 倒置荧光显微镜 日本尼康公司 新飞 BCD2080 冰箱 新飞电器有限公司 高速冷冻离心机 美国 Sigma 公司 微滤装置 PallGelman Laboratory 超净工作台 苏州净化设备有限公司 核酸电泳仪 北京六一 PCR 仪 pH 酸度计 雷磁 SHP205B 生化培养箱 天津天宇实验仪器有限公司 国华 250 生化培养箱 深圳天南海北公司 MGC250 光照培养箱 上海一恒科技有限公司 微型漩涡混合仪 上海沪西分析仪器厂有限公司 JA4103 电子天平 上海精天电子仪器有限公司 HHS112 电热恒温水浴锅 北京长安科学仪器厂 微量进样器 芬兰 Biohit 公司 Olympus CX31 可拍照显微镜 日本 OLYMPUS 公司 试验方法 FISH 试验 杂交 条件的优化 本 试验 以 EUB338 探针为例 针对杂交温度、探针浓度以及溶菌酶的浓度设计了 3 因素 3水平正交试验以及 拟水平法正交试验设计 以求得杂交的最佳条件。 表 24 因素 水平 1 2 3 杂交温度 A(℃ ) 46 48 50 探针浓度 B( ng/ul ) 5 10 20 溶菌酶浓度 C( mg/ ml ) 10 30 50 表 25 拟水平法正交试验设计 因素 水平 1 2 3 杂交温度 A(℃ ) 48 50 48 探针浓度 B( ng/ul ) 20 25 30 溶菌酶浓度 C( mg/ ml ) 1 5 10 FISH 技术 分析 CGMP 对小鼠肠道菌群的影响 [28] （ 1） 粪便样品采集及前处理： 分别在试验的第 0、 15 天 采集 两组 小鼠新鲜粪便置于密封的无菌厌氧带袋 ， 存于冰盒中，并尽可能早地进行处理。 将无菌采集的粪便样品 置于 5mL 离心管 (RNasefree)中， 然后加入 于 PBS（ 大小的膜过滤）中，充分震荡混匀。 然后将上述粪便样品 4℃ 下 700g 离心 2min 以除去粪便中的残渣部分。 （ 2） 固定： 取 1ml上述 离心上清液置于 3ml新鲜配置的 4%的 PFA液（多聚甲醛溶于 PBS， 的膜过滤处理）， 4℃ 固定约 16h（如果不及时进行杂交的话 20℃ 保存在50%（ v/v）的乙醇 PBS 中）。 （ 3） 玻片制备： 向 固定好的菌液 中加入 10ul 浓度为 10mg/ml 溶菌酶（溶菌酶溶于100mMTrisHcl 液 ,PH=） 37℃下孵育 20min。 取 10ul 上述固定液 均匀涂抹于干净的用多聚赖氨酸处理过的载玻片上（可根据靶细菌的数量不同用 PBS 来进行适当的进行稀释 ，其中检测双歧杆菌时菌液稀释 107倍，检测乳酸杆菌时菌液 稀释 108倍，检测肠杆菌时菌液稀释 103倍，检测肠球菌时菌液稀释 102倍 ）。 然后用乙醇梯度（ 50%， 75%， 95%）对细菌进行脱水各 2min，室温干燥。 （ 4） 杂交以及杂交后处理： 将杂交缓冲液（探针 终 浓度为 20 ng/ul）均匀加到载玻片表面，覆盖盖玻片 （ RNasefree）， 48℃ 湿盒中杂交过夜约 16h。 用漂洗缓冲液 48℃ 浸泡 30min（洗去未杂交上的探针），然后用双蒸水快速漂净，干燥，立即进行荧光显微检测。 （ 5） 计数： 随机抽取 15 个视野，采用 DS5MC 荧光显微系统和 NISElements BR 成像分析系统进行细菌荧光显影计数。 CGMP 对小鼠肠道菌群群落结构的分析 主要化学试剂 PCR 反应所需的 Buffer、 Taq DNA 聚合酶、 dNTP 等购自 TakaRa 公司 , 所需ERIC 引物（ ERIC1： 5,ATGTAAGCTCCTGGGGAATCAC3, ERIC2： 5,AAGTAAGTGACTGGGGTGAGCG3， ） 由上海生工公司合成。 试验动物及分组： 实验动物： 25～ 30g 健康的 BALB/c 雄性小鼠， 购自中国人民 解放军 军事医学科学 实 验动物中心 ，合格证号为： 0038134。 将实验动物适应饲养一周后随机分成 2 组。 其中对照组每天灌胃 生理盐水， CGMP 组每天灌胃 浓度为 ， 灌胃周期为 2周。 ERICPCR 反应条件的优化 在文献报道的基础上，本试验针对肠道微生物总 DNA 进行 ERICPCR 扩增体系（ Mg2+ 、 Taq 酶、引物量）进行了一定的优化。 ERICPCR 扩 增 程 序： 94 ℃ 预 变 性 5 min； 94℃ 变性 50 s， 48℃ 退火 90 S， 72℃ 延伸 3 min， 35 个循环； 72℃ 最后延伸 9 min； ERICPCR 反应中 Mg2+浓度优化 如表 26 所示，在 50ulPCR 反应 体系中 Mg2+浓度 梯度 分别设为 ： 、2mM 、 、 3mM。 其中 A、 B、 C、 D分别是 四 个不同的基因组 DNA 模板。 表 26 Mg2+浓度 编号 A B C D A1 B1 C1 D1 2mM A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 3mM A4 B4 C4 D4 ERICPCR 反应 体系 中 Taq 酶浓度优化 如表 27所示，在 50 μLPCR 体系中 Taq 酶浓度分别设为： 、 、 、 5U。 其中 A、 B、 C、 D分别是 四 个不同的基因组 DNA 模板。 表 27 Taq 酶浓度 编号 A B C D A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 5U A4 B4 C4 D4 ERICPCR 反应 体系 中引物浓度优化 如表 28 所示，在 50 μ LPCR 体系中引物浓度分别设为： 、 、 、。 其中 A、 B、 C、 D分别是 四 个不同的基因组 DNA 模板。 表 28 引物浓度 编号 A B C D A1 B1 C1 D1 A2 B2 C2 D2 A3 B3 C3 D3 A4 B4 C4 D4 试验方法 ： 采样 分别在试验的第 0、 1 21 天 （即停止灌胃后一周） 采集 两组 小鼠新鲜粪便置于密封的无菌厌氧带袋， 存 于冰盒中，并尽可能早地进行处理。 样品的前处理 取 200mg 粪便样品置于 2ml 离心管中，加入 1mlPBS (pH )，充分均质化后 200g 离心 6min，取上清。 向沉淀中再加入 1mlPBS (pH )， 200g 离心 6 分钟，取上清，合并两次上清再次离心， 300g 离心 6分钟 , 收集上清， 20200g，8min 再次离心收集菌体，用 PBS将菌体洗涤两次。 粪便微生物总 DNA 的提取 [29] 向上述所得菌体中加入 300ul 裂解液Ⅰ（ 150mM Nacl , 100mM , pH=）， 10%的溶菌酶 100ul， 1%的 RnaseA 40ul，混合均匀 37℃保温 40min。 然后加入 300ul 裂解液。