猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况的检测与分析毕业论文(编辑修改稿)

猪瘟和蓝耳病疫苗中牛病毒性腹泻病毒污染情况的检测与分析毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

[4]。 各种年龄的牛都可感染牛病毒性腹泻，以幼龄牛易感性最高， 在垂直传播后 ， 会产生病毒血症。 以含 BVDV 的血清作为原料时，就会污染制备的生物制品 [5]。 猪瘟细胞苗生产过程中会使用到牛睾丸细胞以及牛血清 [6]；蓝耳病疫苗（尤其是 弱 毒 疫 苗）生产工艺中在传代细胞培养中会使用到牛血清，如果血清材料含有 BVDV 病原或抗体，会使猪瘟细胞苗和蓝耳病疫苗污染。 疫苗被 BVDV 污染后，会对其免疫效果产生干扰。 BVDV 抑制疫苗抗体的产生，同时刺激机体产生大量针对BVDV 的抗体，导致疫苗免疫失败，表现为被接种动物体内存在较高水平抗体却依然会爆发传染病，其多数为 BVDV 抗体 [7]。 此外，猪在接种了受污染的疫苗后也可能感染 BVDV，产生类似于猪瘟的临床症状和病理变化 ， 王新平等 [8]从疑似猪瘟病料中检出了 BVDV。 近年，我国发现猪场出现不明原因的猪瘟和蓝耳病免疫失败现象，可能原因是疫苗受 BVDV 污染，导致免疫失效，母猪感染后还会出现交配困难、不孕、流产等现象 [9]。 若不能及时监测出疫苗中 BVDV 污染情况，会造成重大经济损失甚至传染病的流行。 因此，对猪瘟和蓝耳病疫苗受 2 BVDV污染情况的监测与分析十分有必要。 目前 ， 可用 于 检测疫苗中 BVDV 病原的方法主要有：牛肾细胞直接病变、免疫荧光技术（ indirect immunofluorescence, IFA）、酶联免疫吸附试验（ enzymelinked immunoadsorbent assay, ELISA）、病毒中和试验（ Virus neutralization test, VNT）、琼脂扩散试验、 RTPCR 等 [10]。 BVDV 与 CSFV 基因组核苷酸同源性可达 60%，氨基酸同源性可达 85%[11]，血清学上可出现交叉反应[12]。 污染 BVDV 的 CSFV 疫苗免疫后，采用血清学方法无法准确区分血清抗体是由 BVDV 感染产生的还是由 CSFV 弱毒疫苗产生的。 近年，分子生物学技术广泛应用于 BVDV 的病原诊断，具有敏感、特异、快速、灵活、操作简便的特点，并可用于各种组织、全血等样品检测。 因此，本文拟采用 RTPCR 方法对CSFV和 PRRS 弱毒疫苗污染 BVDV情况进行检测与分析 ，对指导畜牧业生产中科学使用疫苗有重要的指导意义。 1 材料与方法 试验材料 试验疫苗 由中国动物卫生与流行病学中心从全国各地猪场收集其使用的猪瘟 细胞苗和蓝耳病 弱毒 疫苗，进行初检，选取怀疑为阳性的疫苗作为本试验用 样品。 试验试剂 RNA 提取试剂（如： Trizol、冷氯仿、异丙醇、 75%酒精、 DEPC 处理水等）、引物、感受态细胞、 AMP、 IPTG、 Xgal 等由中国动物卫生与流行病学中心提供，One Step SYBR PrimeScript RTPCR Kit（一步 RTPCR 试剂盒）、 ExTaq 酶（ MIX）、DNA Marker20 pGEMT easy Vector 购自 Promega 公司，胶回收试剂盒购自QIAGEN 公司， Quick Ligation Kit、连接酶 Buffer 购自 New England Biolabs 公司，DURED 染料购自泛博生物化学有限公司。 试验主要仪器设 Sigma 318 离心机购自 Sigma 公司、 BSC 1300IIB2 生物安全柜购自新华医疗器械股份有限公司、 LSP96G PCR 仪购自 Labserv 公司、 DYYi2 电泳仪购自北京六一仪器厂、 BioRad 凝胶成像仪购自 BioRad 公司、 BGgds VIEW可见紫外分析仪购自北京百晶生物技术有限公司、细胞温箱购自上海福玛实验设备有限公司、 SDC6 恒温槽购自宁波新芝生物科技公司、 HZQC 空气浴振荡器购自东 3 联电子技术开发有限公司。 试验方法 RNA的提取 (1) 取疫苗 250 uL加入无 RNA 酶的 EP 管中，加入 750 uL Trizol 混匀，后室温放置 5 min， 间或震荡。 (2) 加入 20℃ 保存的冷氯仿 250 uL 剧烈震荡混匀后置于 4℃ 冰箱 10 min。 (3) 置于离心机中以 12020 r/min， 4℃ 离心 15 min。 (4) 取 500 uL 上清（宁可少也不要取到沉淀物）于 EP 管中，加等量（ 500 uL）异丙醇，轻轻颠倒混匀，于 80℃ 冰柜沉淀 30 min。 (5) 将液体以 12020 r/min， 4℃ 离心 10 min。 (6) 弃去异丙醇，加入 75%酒精 1000 uL， 混匀，于 4℃ 冰箱静置 5 min。 (7) 将液体以 12020 r/min， 4℃ 离心 5 min。 (8) 弃去酒精，晾干后用 30 uL DEPC 处理水溶解，于 20℃ 冰柜保存。 RTPCR检测 BVDV NCBI 网站 GenBank 给出 6 对供参考的 BVDV 扩增引物序列，经过试验研究，套式引物效果最好 [14]因此本试验选用套式引物，对 NS5B 基因序列进行扩增，其中的引物为 P P P P4。 P1： 1048510583 5’ATCTTTCACACATAGCCCAAC3’ P2： 1124411264 5’GAAGCCATCATCCCCACGACG3’ 提取出来的 RNA 用 P P2 引物于 PCR 仪中进行一步 RTPCR，反应体系如表 1。 表 1 RTPCR的反应体系 试剂 用量 (uL) Primescript RT Enzyme MIX 2X One Step SYBR RTPCR Buffer F(P1) R(P2) ddH2O RNA 反应程序为 50℃ 反应 30 min， 94℃ 反应 2 min， 94℃ 变性 30 s， 55℃ 退火 30 s， 72℃ 延伸 1 min， 此三步为 30 个循环，后 72℃ 反应 10 min，最后 4℃ 保存。 4 巢式 PCR扩增 P3： 1047710498 5’TGGAGATCTTTCACACAATAGC3’ P4： 1081510836 5’GCTGTTTCACCCAGTTATACAT3’ 用 RTPCR 的产物为模板，利用引物 P P4 进行巢式 PCR 扩增，反应体系如表 2。 表 2 巢式 PCR扩增 试剂 用量（ uL） ExTaq 酶（ MIX） F(P3) R(P4) ddH2O DNA 反应程序为 94℃ 反应 3 min， 94℃ 变性 30 s， 55℃ 退火 30 s， 72℃ 延伸 1 min， 此 3 步为 33 个循环，后 72℃ 反应 10 min，最后 4℃ 保存。 琼脂糖凝胶电泳 (1) 在管中加好琼脂糖至标度。 (2) 将固体琼脂糖加至锥形瓶，加缓冲液（ 1:100）。 (3) 在瓶口套上一次性手套在微波炉中加热 3 min。 (4) 取电泳板并在上面加上玻璃板，再插上梳子。 (5) 取出锥形瓶加染色剂 5 uL（染色剂不稳定，加热之后再加防止分解）。 (6) 将琼脂倒入玻璃板上至半个梳子高度（不要倒出气泡），静置 1520 min。 (7) 加 DNAmarker 2020 5 uL 加入第一个或中间的孔。 (8) 将扩增产物取 5 uL 加入平板孔中。 (9) 将玻璃平板取出放入电泳池，对齐放平，盖好盖，调至 130 V， 130 mA启动，电泳 30 min。 (10) 将胶取出孔朝上放入凝胶成像仪中，先开白光调整位置，后打开紫外光先自动曝光，等到一个合适的亮度后手动曝光，保存。 胶回收提纯 将凝胶成像仪中呈现较亮的 360 bp 左右的片段的 PCR 未纯化产物送上海生工公司测序，有 3 个 样品 测序失败，需进行 目的 DNA 的 克隆 转化。 (1) 进行电泳后在凝胶成像仪中找到目的片段。 (2) 在切割仪中垫上一个一次性手套，放上凝胶，打开紫外灯，尽可能小的 5 切下目的条带并分装到 EP 管中，并在天平中进行称重。 (3) 使用 QIAGEN 公司的胶回收试剂盒，按重量的 3 倍体积加入 Buffer QG。 (4) 将 EP 管装在漂浮板上在水浴温箱中 50℃ 水浴加热 10 min左右，直至凝胶完全溶解。 (5) 将液体移入涡旋管中， 12020 r/min， 22℃ 离心 1 min， 弃掉滤液。 (6) 加入 750 uL Buffer PE 洗液 12020 r/min， 22℃ 离心 1 min， 弃掉滤液。 (7) 开着盖 12020 r/min， 22℃ 离心 1min， 换一个 EP 管。 (8) 加 Buffer EB 洗脱液 40 uL， 室温静置。