惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响毕业论文(编辑修改稿)

惰性载体对瘤胃真菌产酶活性的影响毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

），溶解后再依次加入已称量好的 3,5二硝基水杨酸 g、氢氧化钠 g、重结晶苯酚 g，无水亚硫酸钠盐 g，用玻璃棒搅拌至完全溶解，冷却后定容至 1000 mL棕色容量瓶内，避光保存，放置一周后取上清液使用。 成分 Composition 碳酸氢钠 NaHCO3 葡萄 糖 Glucose 酵母膏 Yeast cream 蛋白胨 Pepton 缓冲液 A Buffer A 缓冲液 B Butter B 无细胞瘤胃液 Cellfree rumen fluid 蒸馏水 Distilled water 含量 g g g g 165 mL 165 mL 170 mL 500 mL 7 菌种扩繁 菌种活化 将保存在 20℃ 中的 B 菌种平板培养基取出，置于 39℃ 下解冻备用。 在超净台中进行无菌接种，右手取接种环在酒精火焰上灼烧灭菌，先将环烧热至发红，然后将整个细金属丝烧红，再将接种环倾斜，沿 着环向上依次烧，直到烧至可能碰到培养基的部分，如此返回在烧到环端，来回通过火焰数次。 待接种环自然冷却（或蘸取平板内水珠冷却）后，刮取 已在室温下解冻的平板上的菌落，左手持琼脂平板，在靠近酒精灯火焰 处 略开盖。 右手持已取标本的接种环伸入到琼脂平板表面一侧边缘，利用腕力将接种环在平板上来回划线。 传代培养 上述菌株培养三天后，进行菌体传代扩繁。 将已配好的 2 L 液体种子培养基分别均分于 10 个 1725 cm封口袋中（即每袋 200 mL），再把已活化的菌 接种到封口袋中，仍置于39℃ 的温箱中进行传代培养 3 天， 观察菌体生长情况，此操作依旧需要在超净台中进行。 菌体一般传 3 代后可满足试验需要量。 试验设计 本试验采用二因素试验设计，载体类型为珍珠岩、沸石、膨润土，载体添加量分别 %、%、 %。 试验方法及酶活测定 每个固态培养基重 200 g，其中添加固态底物 80 g，其余为水分（包含菌体培养液）。 固态底物和已与菌体培养液 20 mL 混合的载体混合 物拌匀 后装袋，经抽真空后置于 39℃ 温箱中发酵，每隔 2 天采样测酶活。 取固态培养物 1 g 左右于 15 mL 离心管中，用移液枪向离心管中加入 10 mL pH= 的柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液，震荡混匀后，静置 30 min，然后置于 4000 r/min 高速离心机离心 30 min，取上清液于 10 mL 离心管中，置入 4℃ 的冰箱中冷藏备用，测定其中的羧甲基纤维素酶 （ Carboxymethyl cellulose, CMC）、微晶纤维素酶（ Microcrystalline cellulose, MCC）、 β葡萄糖苷酶（ βglucosidase, BGL）、滤纸酶（ filter paper enzyme, FPA） 活性。 羧甲基纤维素酶（ CMC）活性测定 葡萄糖标准曲线的绘制参照朱崇淼等 [5]的方法稍加改进，分别称取已经烘干恒重的葡萄糖 g、 g、 g、 g、 g，分别溶于 5 个 25 mL 的小容量瓶中，配成用于绘制标准曲线的葡糖糖标准溶液，然后分别再取 mL上述标准溶液于 10 mL 离心管中，空白组加入 mL 蒸馏水代替标准溶液，再向每个离心管中加入 1 mL 蒸馏水和 mL 缓 8 冲液，混匀后置于 50℃ 水浴中加热 5 min，最后加入 3 mL DNS 溶液，沸水浴 5 min 后迅速置于冷却，将紫外分光光度计设置在 550 nm 波长处测取吸光值。 绘制标准曲线，如图 1。 本试验参照 Lowe 等 [8]方法稍加改良，取已配好的羧甲基纤维素钠（ CMC）溶液 1 mL于 10 mL 离心管中，再加入 mL pH= 的柠檬酸 磷酸氢二钠溶液，置于 50℃ 水浴锅预热 5 min 后，后加入稀释 10 倍的发酵液 mL，混合均匀， 50℃ 水浴加热 30 min 后，加入 DNS 溶液 3 mL，沸水浴 5 min 后迅速置于冷水冷却，置 550 nm 波长读取吸光值。 对照组发酵液上清液经煮沸灭活后作对照。 以葡萄糖标准曲线为标准，计算所测的上清液释放的葡萄糖具体 含量。 酶活力定义为在上述条件下，每分钟释放 1 μmol 葡萄糖的酶量为一个酶活单位（ U），换算成每 克 干物料含有的酶活，以 U/g（干物质）。 酶活力计算： 酶活力 (U/g)=WN1000/(TmM)。 W酶解反应产生得葡萄糖量，从葡萄糖标准曲线上查得，单位： g； T反应时间， 30 min； N酶液得稀释倍数； 50 M葡萄糖分子量， g/mol； m样品干物质质量， g。 微晶纤维素酶 (MCC)活性的测 定 本试验此方法根据 Hossam M[9]的方法改良。 取 1 mL 微晶纤维素的溶液于 10 mL 离心管中，加入 mL pH= 柠檬酸 磷酸氢二钠缓冲液， 50℃ 水浴预热 5 min 后，加入 mL稀释 10 倍的发酵液上清， 50℃ 水浴保温 30 min 后，加 3 mL DNS 溶液， 100℃ 沸水浴 5 min显色冷却后，置于紫外可见光光度计中 550 nm 波长读取吸光值，对照组以经煮沸灭活的发图 1 葡萄糖标准曲线 Standard curve of glucose y = 0 . 0 8 9 5 xR 178。 = 0 . 9 9 800 . 10 . 20 . 30 . 40 . 50 1 2 3 4 5 6葡萄糖含量（g）吸光值 9 酵液上清作对照，然后以葡萄糖标准曲线为标准，计算所测上清液释放的葡萄糖含量。 酶活力的定义同上文所述的羧甲基纤维素酶。 β葡萄糖苷酶 (BGL)活性测定 取 1 mL 水杨素溶液于 10 mL 离心管中，加入。