弗氏柠檬酸杆菌tpl基因的体外扩增毕业论文(编辑修改稿)

弗氏柠檬酸杆菌tpl基因的体外扩增毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

17 页 第 4 页 本课题的立题依据和研究内容 立题依据 酪氨酸酚裂解酶（ Tyrosine Phenollyase， TPL， EC ） 也称 β酪氨酸酶，在生物体内催化 L酪氨酸裂解生成苯酚、丙酮酸和氨，但在生物体外可将苯酚、丙酮酸和氨转化为 L酪氨酸，而 L酪氨酸常作为营养补充剂、苯丙酮尿症患者的必需氨基酸， 是 L多巴 的重要 制备原料。 此外，该酶 在 磷酸吡哆醛的作用下， 能够催化一系列的 α、 β 消除反应、 β 取代 反应以及 α、 β 消除反应和消旋反应的逆转。 因此 TPL 是一种广泛应用于医药行业的酶类，解决它的大规模工业化生产是一个迫在眉睫的问题。 本课题 应用分子生物学手段，通过 PCR 体外扩增技术，体外合成目的基因，并扩大培养，得到目标产物，简化了生产过程，为生物制剂的大规模工业生产提供了一定的借鉴。 研究内容 （ 1）弗氏柠檬酸杆菌的培养 （ 2） 目的基因的构建与体外扩增 （ 3）表达产物的鉴别 常州工程职业技术学院毕业设计（论文） 共 17 页 第 5 页 2 实验 原理 SDS 法制备基因组 DNA 的原理 细菌基因组 DNA （染色体 DNA）的提取一般是先用溶菌酶处理，破坏 细菌细胞壁，然后再加入 SDS 和 /或蛋白酶 K，使细菌细胞裂解，同时解离与核酸结合的蛋白质，再利用有机溶剂使蛋白质彻底变性。 通过离心，细胞碎片及变性蛋白质复合物被沉淀下来，而 DNA 择留在上清液中，利用乙醇或异丙醇沉淀溶液中的 DNA。 用无 DNA 酶的 RNA 酶水解溶液中的 RNA，最终获得纯度较高的细菌 DNA。 溶菌酶（ lysozyme）是一种能水解粘多糖的碱性酶，它通过破坏细菌细胞壁中的 N乙酰胞壁酸和 N乙酰氨基葡萄糖之间的 β1,4 糖苷键，使细胞壁不溶性粘多糖分解成可溶性糖肽，从而使细菌细胞壁破裂。 SDS 是一种强 阴离子去污剂，其主要作用是： ① 结合膜蛋白而破坏细胞膜、核膜； ② 是核蛋白体（ DNP）中的蛋白质与 DNA 分离； ③ 与蛋白质结合，使蛋白质变性而沉淀。 蛋白酶 K能在 SDS 和 EDTA 存在的情况下保持较高的活性，可将与 DNA 结合的蛋白质降解成小肽或氨基酸，使 DNA 分子完整地分离出来。 EDTA 也具有降低细胞膜稳定性，并抑制 DNase 活性的作用。 TrisHCl（ ）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 高浓度的 NaCl 可使蛋白质、多糖等杂质沉淀。 上清液用酚 /氯仿 /异戊醇反复抽提除去蛋白质，再用乙醇或异丙醇沉淀中的 DNA。 琼脂糖凝胶电泳原理 DNA 分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 DNA 分子在高于等电点的 pH 溶液 中带负电荷在电场中向正极移动。 由于糖－磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链 DNA 几乎具有等量的净电荷，因此他们能以相同的速度向正极方向移动。 在一定的电场强度下， DNA 分子的迁移速度取决于分子筛效应，即 DNA 分子本身的大小和构型。 具有不同的相对分子质量的 DNA 片段泳动速度不一样，可进行分离。 DNA 分子的迁移速度与相对分子质量对数值成反比关系。 凝胶电泳不仅可以分离不同相对分子质量的 DNA， 也 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的 DNA 分子。 常州工程职业技术学院毕业设计（论文） 共 17 页 第 6 页 PCR 反应原理 聚合酶链反应（ polymerase chain reaction， PCR）是体外酶促合成特异 DNA片段的一种技术。 利用 PCR 技术可在数小时之内大量扩增目的基因或 DNA 片段，从而免除基因重组和分子克隆等一系列繁琐操作。 由于这种方法操作简单、实用性强、灵敏度高并可自动化，因而在分子生物学、基因工程研究以及对遗传病、传染病和恶性肿瘤等基因诊断和研究中得到广泛应用 引物设计的基本原则 PCR 反应中有两条引物，即 5′端引物和 3′引物。 设计引物时以一条 DNA单链为基准（常以信息链为基准）， 5′端引物与位于待扩增片段 5′端上的一小段DNA 序列相同； 3′端引物与位于待扩增片段 3′端的一小段 DNA 序列互补。 ① 引物长度： 1530bp，常用为 20bp 左右。 ② 引物碱基： G+C 含量以 4060%为宜， G+C 太少扩增效果不佳， G+C 过多易出现非特异条带。 ATGC 最好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。 ③ 引物内部不应出现互补序列。 ④ 两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免 3 ′端的互补重叠。 ⑤ 引物与非特异扩增区的序列的 同源性不要超过 70%，引物 3′末端连续 8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增。 ⑥ 引物 3‘端的碱基，特别是最末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，最佳选择是 G 和 C。 ⑦ 引物的 5 ′端可以修饰。 如附加限制酶位点 ，引入突变位点，用生物素、荧光物质、地高辛标记，加入其它短序列， 包括起始密码子、终止密码子等 PCR 反应参数 1. 变性：在第一轮循环前 ,在 94℃ 下变性 510min 非常重要 ,它可使模板 DNA 完全解链 ,然后加入 Taq DNA 聚合酶 (hot start),这样可减 少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。 变性不完全 ,往往使 PCR 失败 ,因为未变性完全的 DNA 双链会很快复性 ,减少 DNA 产量 .一般变性温度与时间为 94℃ 1min。 在变性温度下 ,双链 DNA 解链只需几秒钟即可完全 ,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。 对于富含 GC 的序列 ,可适当提高变性温度 .但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。 常州工程职业技术学院毕业设计（论文） 共 17 页 第 7 页 2. 退火：这是 PCR 的一个关键参数。 在理想状态下，退火温度足够低，以保证引物同目的序列 有效退火，同时还要足够高，以减少非特异性结合。 合理的退火温度从 55℃ 到 70℃。 退火温度一般设定比引物的 Tm 低5℃, 当产物中包含有影响实验的非可异性扩增带时 ,以 2℃ 为增量，逐步提高退火温度。 较高的退火温度会减少引物二聚体和非特异性产物的形成。 如果两个引物 Tm 不同，将退火温度设定为比最低的 Tm 低5℃。 或者为了提高特异性，可以在根据较高 Tm 设计的退火温度先进行 5 个循环，然后在根据较低 Tm 设计的退火温度进行剩余的循环。 这使得在较为严紧的条件下可以获得目的模板的部分拷贝。 退火温度越高 ,所得产物的特异性越 高。 有些反应甚至可将退火与延伸两步合并 ,只用两种温度 (例如用 60℃ 和 94℃) 完成整个扩增循环 , 既省时间又提高了特异性。 退火一般仅需数秒钟即可完成 ,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。 3. 延伸：延伸反应通常为 72℃, 接近于 Taq DNA 聚合酶的最适反应温度 75℃.实际上 ,引物延伸在退火时即已开始 ,因为 Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从 20℃ 85℃. 延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度 .在一般反应体系中 ,Taq DNA聚合酶每分钟约可合成 1kb 长的DNA。 延伸时间过长会 导致产物非特异性增加 .但对很低浓度的目的序列 , 则可适当增加延伸反应的时间。 一般在扩增反应完成后 ,都需要一步较长时间 (1030min)的延伸反应 ,以获得尽可能完整的产物 , 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。 4. 循环次数：当其它参数确定之后 , 循环次数主要取决于 DNA 浓度。 一般而言 2530 轮循环已经足够。 循环次数过多 ,会使 PCR 产物中非特异性产物大量增加。 通常经 2530 轮循环扩增后 , 反应中 Taq DNA 聚合酶已经不足 , 如果此时产物量仍不够 , 需要进一步扩增 ,可将扩增的DNA 样品稀释 103105 倍作为模板 , 重新。