巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子ein3的western印迹毕业论文(编辑修改稿)

巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子ein3的western印迹毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

10% APS ddH2O TEMED 5181。 l （ 5） Loading buffer(上样缓冲液） SDS 10% w/v Glycerol 20% v/v Triscl Bromphend blue % w/v βmerkapto ethanol 10mM （ 6） Staining buffer(蛋 白胶染色液） Methanol(甲醇） 91ml Acetate(冰醋酸） coomassie brilliant blue R250 H2O 91ml Distaining buffer I(蛋白脱色液 Ⅰ ） Methanol 50% Acetate 10% H2O 40% Distaining buffer II(蛋白脱色液 Ⅱ ） Methanol 30% Acetate 10% H2O 60% （ 7） TBST buffer Triscl 50mM Nacl 150mM Tween20 % 巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子 Ein3 的 western 印迹 3 方法 步骤 在温室中选取两株长势良好且叶片健康的巴西橡胶树，在两株橡胶树上各选取 6 片叶龄相、无虫咬痕的幼嫩叶片并标记。 每片叶片都用镊子在其正反两面进行刮伤，刮伤完成之后两株各取一片用铝箔包裹保存于 80 度冰箱。 后面分别隔1h、 4h、 6h、 12h、 24h 从两株橡胶树上取叶片铝箔包裹并标记后保存于 80 度冰箱。 取叶片的时间分别为 2020 年 3 月 18 日 9 点、 10 点、 13 点、 15 点、 21 点、次日 9 点。 （处理叶片及取叶片过程中必须戴手套操作且镊子需经过严格消毒 ） 取处理过的低温避光保存的叶片放入 20 度预冷的陶瓷研钵中加入液氮沿一个方向快速研磨，待其研磨成粉末状时加入蛋白提取液继续研磨一定时间后，吸取沉淀装入 2ml 试管中，然后放入 95 度气浴锅中高温加速提取蛋白 10min。 提取完成后称其重量配平后在 14000rpm 的离心机中离心 10min，离心完成后用移液枪吸取上清液于 试管中保存于 20 度冰箱。 其他几个时间处理按此步骤提取蛋白并 20 度保存。 ： 法 Bradford 法属于染料结合法 , 即考马斯亮蓝 G250 在酸性溶液中呈红棕色 ,与蛋白质结合后转变为蓝色 , 颜色深浅与蛋白浓度呈正比关系。 Bradford 法法测定蛋白浓度的范围 为 31 .25 ～ 2 000 μ g/mL。 影响 Bradford 法的主要因素有甘油、乙酸、去污剂和一些碱性缓冲系统。 [1] 法 BCA 法的测定原理为蛋白质价铜离子还原成亚铜离子 , 后者在碱性溶液中与 BCA 结合生成紫红色络合物。 BCA 法标准蛋白浓度设置在 20～ 1 000 μ g/mL 时 r 值仍大于。 影响 BCA 法测蛋白的主要因素有蔗糖、 NH+尿素、 EDTA。 尿素和β 巯基乙醇会干扰 BCA 法的测定 , 所以 BCA 法不适于含有尿素和β 巯基乙醇的变性液中蛋白含量的测定。 [2] method 巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子 Ein3 的 western 印迹 （ 1） 在高通量蛋白定性滤纸上画出 1cm 1cm 的方格。 （ 2） 配置浓度梯度为 、 、 、 白液，并准备 0h、 1h、 4h、 6h、 12h、 24h 的样品蛋白液。 （ 3） 在格子中心用移液枪滴加 5μ l 牛血清蛋白和蛋白样品，每个浓度和样品各两个格子，待其自然干燥。 （ 4） 干燥后置于培养皿中， 加入配置好的 Esen fixing buffer 在摇床上固定蛋白 5min。 （ 5） 弃去蛋白固定液后加入 Esen staining buffer 在摇床上染色 15min。 （ 6） 染色后取出用开水冲洗两次，每次 10min。 （ 7） 待其风干后用剪刀沿染液边缘剪下放入 2ml 试管中 ,加入 %的 SDS 溶液，放入 55 度气浴锅中煮 1h。 （ 8） 取恢复室温后的液体 1ml 在分光光度计中测 OD612。 （ 9） 记录数据并做标准曲线（相似度 R178。 才能根据标准曲线进行蛋白浓度的计算。 （ SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离胶灌制 按照试剂配方配置 10%分离胶 7ml，按电泳槽说明书组装凝胶电泳模具 , 用移液枪吸取 10%分离胶溶液 , 沿隔板缓慢加入模具内中 , 避免产生气泡 ,当加入的溶液至前玻璃板 2cm 时即可停止 .轻轻在分离胶溶液上加入一层 1～ 5mm 的去离子水层 ,这使凝胶表面平整 .等待 15～ 30min，待凝胶聚合 . TEMED 要在注胶前再加入，混合后快速注胶 .注胶过程一次性 完成 , 避免产生气泡。 浓缩胶灌制 按照试剂配方配置 4%浓缩胶 ，用移液枪吸取浓缩胶溶液缓慢加入分离胶上面 ,直至凝胶溶液将要到达前玻璃板的顶端 ,插入梳子 ,凝胶聚合时间约 30 min,然后小心拔出梳子 ,将凝胶放入电泳槽内 ,接好电极 ,将电泳缓冲液加入电泳槽中，要求凝胶的上下端均能浸泡在电泳缓冲液中 .需同时放置两块制好的胶 ,一块用考马斯亮蓝进行染色后脱色观察对照，另一块则进行转膜后的免疫印迹。 制 备样品和上样 把 20度保存的已经确定蛋白浓度的 6组不同处理的蛋白样品按 10μ g的上巴西橡胶树乙烯途径中抑制因子 Ein3 的 western 印迹 样量吸取一定量于 试管中并标记，按照试剂配方配置一定量的上样缓冲液，在各个样品中加入等体积的上样缓冲液混匀后在 95 度气浴锅中煮 10min。 在凝胶的左边第一个孔中各加入 6μ l 的双色预染宽分子量蛋白 Marker。 用来转膜杂交的凝胶 从左到右第。