基于顺铂抗癌药物的合成及dna键和性质的研究_毕业论文(编辑修改稿)

基于顺铂抗癌药物的合成及dna键和性质的研究_毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

图 几种典型的 G四链体结构 a：分子间四聚体结构 (平行 )； b：分子间二聚体邻位发夹型结构 (反平行 )； c：分子内椅状结构 (反平行 )； d：分子内蓝状结构 (反平行 )； e：分子内螺旋桨状结构 (平行 )； f：分子内混合型结构 G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系 端粒是由高度重复序列的端粒 DNA 和端粒结合蛋白组成的复合物。 20世纪三四十年代，Hermann Muller 和 Barbara McClintock 同时提出了端粒的概念。 它是染色体末端的一种特殊结构，能防止染色体 DNA 降解、末端融合、缺失及非正常重组维持染色体的完整和稳定，并保证细胞正常分化。 端粒的主体是双螺旋结构，富 GT链与富 CA链配对，但 3’末端突出为一段单链悬挂。 由于缺乏模板的引导，染色体合成过程中传统的 DNA聚合酶就无法完全合成这个末端悬挂，从而造成端粒缩短，这就是所谓的“末端复制问题”。 端粒是真核细胞染色体末端的一种特殊的核蛋白复合体，由高度重复序列 的端粒 DNA 和端粒结合蛋白组成 [17]。 不同物种的端粒 DNA序列存在差异，但都以富含鸟嘌呤 (G)的重复序列为特征。 人的端粒约有 15 kb 反复串联的 TTAGGG 构成的，并且以 50200bp／次分裂进行缩短，主要组成部分为 515 kb 长的双链 DNA 和 3′末端 100200 bp 长的 G单链悬垂 (Goverhang)DNA。 端粒的主体是双螺旋结构，富 GT 链与富 CA 链配对，但 3′末端突出为一段单链悬挂。 这段单链在名为Shelterin[18]/Telosome[19]的蛋白结构催化下折回到端 粒内部双链，并将该端区域的一段自身链置换出来，取而代之与互补链配对，形成 Tloop (telomere loop)结构，而 3’末端单链被“包埋”在 Tloop中，端粒末端便形成了一个与外界隔绝的闭合结构。 正是由于这个闭合结构，端粒显现出了对于染色体的稳定及其基因组的完整非常重要的作用，它为染色体末端提供保护性，防止染色体互相融合、重组及一些外切酶、连接酶的作用，防止 DNA的损伤，并计数在线性 DNA复制时出现的末端 DNA片断的丢失。 同时，这种结构也使端粒酶不可能持续与端粒 3’末端单链发生作用，从而保证了端粒 长度的恒定。 共 32 页 第 9 页 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 图 左图为人染色体末端的端粒 DNA；右图为人端粒结构示意图 正常细胞的端粒随着细胞分裂进行性缩短，在每一次的复制循环中端粒都要减少 50100个碱基对，细胞在进行大约 50次分裂后就开始衰亡。 端粒的长短在细胞癌变和衰老中起着重要作用。 而端粒的长短可由端粒酶调节。 1985 年 Greider 和 Blackburn 首次从四膜虫细胞提取液合成端粒的实验中，发现了端粒酶活性并同时证实了端粒酶具有维持端粒长度的作用。 端粒酶是一种核酸蛋白质复合物，它能以自身 RNA为模板，将真核生物染色体末 端端粒 DNA加以延伸的酶，所以它又被称为特化 RNA依赖性 DNA聚合酶、反转录酶、端粒末端转移酶。 端粒酶由三个部分组成，包括端粒酶 RNA(hTR)，逆转录酶催化亚基 (hTERT)和端粒酶其它聚合蛋白 (TEP1)[2]，端粒酶的生物功能是合成染色体末端的端粒 ， 是一种依赖于 RNA 的特殊的 DNA 聚合酶，属于逆转录酶类型。 在胚胎发育期，端粒酶的活性很高，而在成熟体细胞中端粒酶的活性则会被关闭，以此来调控细胞的生长、分化和衰老。 但是在大部分肿瘤细胞 (85％ )中，端粒酶则表现出了很高的活性，而在癌周围组织和正常组织 中端粒酶几乎是 没有活性 的。 在正常的体细胞中，端粒酶的活性得到抑制，所以细胞每分裂一次，端粒就会缩短一些，当达到一个临界长度时，细胞染色体就会失去稳定性，然后细胞将发生衰亡和凋亡。 而在肿瘤细胞中，端粒酶的活性被激活，使得它可以维持端粒的长度，从而维持肿瘤的继续分裂、增殖和生长，因此这个细胞不能进入正常的老化和衰亡，从而获得一种永生性。 由此说明端粒酶与细胞的恶性转化及维持分裂增殖具有密切的关系。 因此，以抑制端粒酶活性为目标的肿瘤基因治疗研究已成为一种新的药物作用靶点，而且极有希望成为最安全、有效的治疗肿瘤的理想 途径。 端粒酶抑制剂的研究主要针对其不同的组分及不同的结构， 由于 G四螺旋能阻断 RNA 聚合酶，因此当基因密码区的富含 G 重复序列形成 G四螺旋而又不易解聚时，会起到抑制 RNA 聚合酶的作用，从而引起早期转录的停止。 靶向端粒酶集中在以下三个方面：第一个方面以端粒酶RNA 为靶点，第二个方面是抑制端粒酶逆转录酶活性，第三个方面是 G四链体的稳定剂，第 四个方面是开发端粒酶抑制剂的新靶点。 G四螺旋结构的稳定剂或 G四螺旋形成诱导剂的优势在于 G四螺旋结构具有特异性，故具备更强的选择性，从而大大降低了传统化疗药物的毒性。 由此，以 Gquadruplex 为靶点来寻求能够诱导、稳定或识别四链体结构的小分子是当前研究开发抗肿瘤药物重要途径之一。 综合以上所述， G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系可以归结为下面这个流程图。 共 32 页 第 10 页 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 图 G四链体与端粒、端粒酶和肿瘤的关系示意图 本文所做的工作 本 文将合成一种顺铂配合物，用荧光光谱、紫外光谱 观察金属配合物与 DNA的 G四链体的键合作用及性质。 主要做了以下工作： （ 1） 合成配体 dpqdf。 （ 2） 合成铂配合物 （ 3） 对所合成的配合物进行核磁与质谱检测。 （ 4） 用荧光光谱、紫外光谱观察两种不同辅助配体的钌配合物与 DNA 的 G四链体的键合作用及性质。 共 32 页 第 11 页 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 2 理论部分 配合物与 DNA作用的基本形式 作用于 G四链体的小分子配体是通过识别和稳定 G四链体而抑制端粒酶活性的 ， 研究表明 ，小分子配体和不同结构的 G四链体结合模式不同。 分子模拟显示 ， 配体可以非共价键结合形式堆积在末端 G四分体上 ， 结合在沟上、环上或插入两个 G四分体平面之间。 据文献报道 ， 小分子配体与 G四链体的作用模式主要有两种 :外部堆积模式和插入模式 (如图 21所示 )。 1) 外部堆积模式。 即小分子配体和 Gquadruplex 的末端 G四 链 体形成 共轭 结构； 2) 插入模式。 即小分子配体插入到两个 G四 链 体之间 ； 3) 非特异结合模式。 通过氢键和静电作用于沟槽、 Loop 上。 由于溶液中小分子配体 G四链体之间的结合处于动态平衡状态 ， 导致 NMR图谱很难解析 ， 因此 ， 关于复合物的 NMR结构数据非常缺乏 ， 给研究小分子配体的结合模式带来了困难。 总的 来说 ，插入模式由于只有一部分碱基和配体结合，易失衡，从而导致 整个 Gquadruplex结构的分解。 外部堆积模式来有许多结构特点来维持整个分子能量稳定，末端 G四分体更容易与配体形成共轭结构 ， 结合位点较易识别 ， 动力学稳定 ， 化合物的作用模式更倾向于外部堆积模式。 图 21 小分子与 G四链体的作用模式 (a)外部堆积模式 (b)插入模式 (c)非特异性结合 DNA 与配合物作用的研究方法 光谱学方法 紫外 可见光谱或电子光谱 由于比较灵敏、直观、方便，它是研究金属配合物与 DNA作用最常用的方法之一。 一般来说，DNA加入金属配合物后，会对配合物的光、氧化还原等化学物理性质产生影响，通过研究 DNA加入前后配合物性质的变化可对配合 物与 DNA的相互作用进行初步研究。 吸收光谱是研究配合物与 DNA 相互作用比较直接的一种方法。 配合物与 DNA 结合后，使合物所处的环境发生改变，吸收光谱波长和吸收强度发生变化，配合物与 DNA 作用方式不同，则波长和吸收强度变化不同。 依据电子跃迁的机制，可将配合物的电子吸收光谱分为三种类型： 共 32 页 第 12 页 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 装 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 订 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 线 ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ ┊ 1） 以金离子 Mn+为中心的 dd 跃迁所产生的配位跃迁光谱； 2） 配体至金属或金属离子（ LMCT）或金属离子至配体（ MLCT）的电荷迁移光谱，简称荷移光谱； 3） 以配体 L 为中心的配体间的电子转移光谱（ IL）。 其中金属离子向配体的电子 跃迁发生在金属离子具有充满的或接近充满的 t2g 轨道，而配体具有最低空Π轨道的配合物中。 核酸分子由于其嘌呤和嘧啶碱基具有共轭双键体系，所以在紫外区 260290 nm 处有特征的吸收，这种吸收随分子中各碱基的种类、所占比例以及碱基间的堆积方式等的改变而有所不同。 一般来说，结构越有序，吸收值越低。 因此，我们可利用紫外吸收光谱对上述各核酸分子结构的形成进行初步判断。 当配合物插入到 DNA 碱基对时，对应的吸收峰产生明显的减色效应，并伴有一定程度的红移。 荧光光谱 荧光光谱法是研究小分子与核酸相 互作用的主要手段。 荧光物质在激发光的激发下，由基态跃迁到较高的能级 (激发态 )后，首先通过内转换过程消耗一部分能量，回到第一电子激发态的最低振动能级，同时以光量子的形式发射能量，即为荧光。 配合物以插入方式与 DNA 作用后，由于它的振动模式受到抑制，或免受水分子的淬灭，配合物受到了 DNA 碱基疏水环境的保护，其发光强度一般会增强。 并根据强度的变化来判断与 DNA 作用的强弱。 圆二色谱及 DNA解旋技术 圆二色谱可以检测有无旋光物质的存在 [51， 52]，或比较左、右旋物质的混合物中哪种含量更多，测 定透析后的配合物的 CD 光谱，还可帮助确定配合物与 DNA 的相互作用有无异构选择性。 G四链体或 Imotif 结构在圆二色谱中有着特殊的峰结构：平行型 G四链体在 265nm 附近有正的最大吸收峰， 240nm 附近有负的最大吸收峰；反平行型的 G四链体在 295nm 附近有最大正吸收峰，260nm 有最大负吸收峰；混合式的 G四链体构型则包括了 290nm 附近的正吸收以及特征的265nm 附近的肩峰。 加入配合物后，会使其吸收峰发生移动并改变其强度，明显影响 G四链体的CD 光谱。 这样的一种现象便有了一定的选择性变化，更容易区分 G四链体的构型转化，反应配合物和 DNA 的结合模式。 又由于 CD 光谱法灵敏度高，样品在很低的浓度下就可以检测到特征吸收，圆二色谱成为一个很有效的检测手段。 利用圆二色谱仪同时可以做热变性的实验。 DNA 的变性指 DNA 分子由稳定的双螺旋结构松解为无规则线性结构的现象。 核酸由多链结构 (双螺旋或四螺旋 )变为单链结构的中点温度反应了该结构的稳定性，该温度的变化也反应了结构稳定性的变化。 配合物与 DNA 作用方式不同，则 DNA 熔化温度 (Tm)变化程度就不同。 当配合物与 DNA 以插入方式作用时， DNA 熔化温度 (Tm)变化最 大。 其他光谱法 线二色谱 (LD)和电二色谱 (ED)：线二色谱和电二色谱都是采用与固定光轴方向 (在流动梯度体系中旋转和外加电场，使 DNA 螺旋轴取向固定 )平行或垂直的平面偏振光，测量结合 DNA 后的配合物对垂直和平行于 DNA 的线偏振光的不同吸收。 瞬时共振拉曼光谱：可以探测微环境的变化对配合物激。