类弹性蛋白的分子设计、非色谱纯化及分子动力学模拟_硕士学位论文(编辑修改稿)

类弹性蛋白的分子设计、非色谱纯化及分子动力学模拟_硕士学位论文(编辑修改稿)内容摘要：

.................................................................................. 36 氢键数目分析 .......................................................................................................... 38 末端距值分析 .......................................................................................................... 42 溶剂可及性表面积分析 ........................................................................................ 43 本章小结 ...................................................................................................................... 45 第五章 结论 ...................................................................................................................... 46 第六章 研究展望 ............................................................................................................. 47 参考文献 ............................................................................................................................ 48 攻读硕士学位期间发表学术论文情况 ........................................................................... 52 致谢 .................................................................................................................................... 53 附图 .................................................................................................................................... 54 华侨大学硕士研究生毕业论文 1 第一章 绪论 类弹性蛋白多肽的概述 类弹性蛋白多肽简介 类弹性蛋白多肽 (Elastinlike polypeptides， ELPs)是一种具有弹性功能且对环境温度非常敏感的人造基因工程蛋白质聚合物。 其结构主要由五肽重复序列单元构成，即（ ValProGlyXaaGly, VPGXG），源自于弹性蛋白的疏水区域，其中 Xaa 可以是除 Pro 以外任一氨基酸 [1]。 ELPs 有一个可逆相变过程，称之为反转变温度（ inverse temperature transition， ITT），若环境温度低于该相变温度（ transition temperature， tT ），该多肽在水溶液中为高度可溶，聚合物链保持无序结构，且相当伸展。 相反，当温度高于 时，该含水的多肽链结构就瓦解，并开始聚集，形成一个富含 ELPs 的聚集物。 利用类弹性蛋白的可逆相变特性 ,使其在蛋白纯化、作为药物载体、组织工程等方面得到广泛的应用 [2] 类弹性蛋白多肽的相变机理 相变过程是 ELPs在水溶液中絮聚的过 程，伴有伸展型多肽链的瓦解并与溶液相分离 [34]。 从构象变化上， Urry认为（ VPGVG）重复单元在 ProGly处结构为 β转角（ β turn），而重复的 β转角形成右手螺旋的 β螺旋（ righthanded helix termedβspiral），而 β螺旋可用来解释 tT 效应与 △ tT 机理（ tT effect与 △ tT mechanism）；在分子水平上，当温度高于 tT 时，部分较为伸展且无序的构象转变成较为紧凑的 β螺旋 [56]。 Dybal [7]认为发生相变时，在 Pro与 Val残基处会形成 β(II)转 角；但 Gross [8]等认为，在整个相变的过程中，聚合五肽 (GVGVP)n并不存在 β螺旋构像，而 β折叠（ β sheets）则是其最基本的规则构象（ the basic regular part of conformation）； Serrano等 [9]研究表明升高温度会使得 β螺旋聚集在一起，在 1℃ 的相变温度范围内，他们观测到有 25％的氨基酸在链内形成了 β折叠。 Urry 从振动熵的形成及疏水性聚集两方面来阐述 (GVGVP)n 的相变机理。 在(GVGVP)n 疏水区域内有序体运动链节会产生相互作用， 由于疏水区域内部运动链华侨大学硕士研究生毕业论文 2 的阻尼作用，疏水性区域聚集会引起振动熵的上升，疏水性区域聚集的发生是伴随着蛋白疏水部位共振，而温度在一定范围内上升时有助于疏水作用加强。 在相变发生时，增加温度会使在水环境中的聚合物有序性得到加强，而包围在疏水性残基的有序水分子变成无序状态，此时疏水性基团将与水溶液相分离，结果在整个变化过程中是趋于无序性的，这与热力学第二定律相吻合 [1011]。 从能量变化角度来看，相变过程是一个复杂多步的转变，在该转变过程中，某些步骤是吸热的，这可能与疏水性水合作用的损耗有关；而其它步骤均是放热的，结果导致 ELPs 多肽链以物理方式（范德华力）聚集在一起，但在这一过程中 ELPs放热组份数量还不及吸热组份数量三分之一 [12]。 影响 Tt 的各种因素 重复序列次数、浓度对 Tt影响 Meyer D E等 [13]利用递归定向连接 (recursive directional ligation， RDL)技术，成功地表达出三种不同单体类弹性蛋白文库，结果发现， ELPs的 tT 可作为其五肽重复序列次数的函数。 当五肽重复序列次数较少时， ELPs的 tT 随重复序列的重复次数的增加而下降较明显，当五肽重复序列 次数较大时， ELPs的 tT 随重复序列重复次数的增加，其值变化不大。 Meyer D E等 [14]分析 ELP[V5A2G3]文库的 tT 与 ELPs浓度关系时，结果表明： tT 随着 ELPs浓度的上升而下降，并且呈线性关系。 即 bCmTt  )ln( ， m 代表斜率，ELPs单体不同，其值也不相同， C 为 ELP浓度。 Xaa 对 Tt的影响 Lim D W等 [15]在 Xaa中选取可电离的 Lys，与疏水的 Phe相比，前者可以提高 ELPs的盐敏感度以降低 ELPs的 tT。 通常情况下，相似分子量的 ELPs–[KV2F]家族的 tT 比 ELPs –[KV7F]家族要高 16～ 42176。 C，这是因为 ELPs–[KV2F]家族的赖氨酸含量比 ELPs–[KV7F]家族高 2倍以上。 华侨大学硕士研究生毕业论文 3 盐浓度对 Tt的影响 对于所有的 ELPs， tT 均随 NaCl浓度增加而下降。 根据经验，每增加 1M的 NaCl浓度， tT 就相应地减少 15℃左右。 然而，这种影响效应会随着 ELPs分子中带电氨基酸的不同而变化，在溶解液中， ELPs的 tT 的离子效应遵循 霍夫迈斯特离子 序(Hofmeister series)。 但有时一些盐离子可以提高 tT ，例如胍盐 [15]。 分子量对 ELPs 的 Tt影响 Girotti A等 [16]对一系列的 ELPs模型进行研究时发现，随着分子量下降， ELPs的 tT却逐渐上升。 ELPs的长度与聚合物的疏水性存在一个平衡，由于受到 ELPs聚合物链末端的影响，这种影响对低分子量的 ELPs的效应更大，如果 ELPs分子量越低，疏水性就越小。 然而，这种链末端的极性并不能有效说明这一情况， Girotti A认为，分子量对 tT 的影响更大部分取决于聚 合物链内疏水性相互作用而产生的絮集作用。 因而，如果 ELPs链比较短时，就降低了聚合物链内部疏水性相互作用的效率，所以絮集作用就受抑制。 pH 对 Tt的影响 Girotti A等 [16]通过实验表明，在相同 ELPs浓度下，ELPs[(VPGVG)2VPGEG(VPGVG)2]n（ n分别为 5， 9， 15， 30， 45），它们的 tT 均显示出相同的趋势：当低于某一个给定的 pH时， tT 值几乎保持常数，当高于这一特定的 PH值时， tT 就迅速增加。 这一趋势可以这样解释：由于 pH增加，谷氨酸的 γ羧基团逐渐开 始去质子化，去质子化导致其极性的增强，结果使得 Tt向更高的温度转变，以上这些因素主要取决于 ELPs的亲疏水性，而在带电的羧酸根附近不可能有这种水合状态（ hydration mode）。 其它与 Tt有关的因素 ELPs[KV2F8] 和 ELPs[KV7F9]，分别只有 40和 45个氨基酸，是到目前为止最短的 ELPs纯化标签，这两种 ELPs（ free ELPs）是不能通过反相转换循环 (Inverse 华侨大学硕士研究生毕业论文 4 transition cycling ITC)纯化出来，但这两种 ELPs的融合蛋 白是可以通过 ITC被提纯的，因为 ELPs的融合蛋白的 tT 比纯粹的 ELPs（ free ELPs）的 tT 低 [14]。 ELPs的重复序列次数、浓度、 Xaa、盐浓度、 pH及分子量是影响类弹性蛋白 tT 主要因素，由于 ELPs是一种对环境有很大敏感性的生物高分子，影响类弹性蛋白 tT 还有其它多种因素。 类弹性蛋白多肽的合成方法 ELPs 合成方式主要有两种：一种是化学法，另一是基因重组合成法，后者为目前主流方法。 前者的优势是可以在 ELPs 序列特定的位点导入一些非天然氨基酸，但进行大规模生产却比较困难。 与化学合 成法相比，使用基因重组合成法具有以下优势：可通过基因模板控制 ELPs 序列、立体化学、分子量；且 ELPs 的转化菌株可以永久性生产 ELPs；细胞内折叠机制可帮助 ELPs 折叠成正确的二级或三级结构 [2]。 基因重组合成法更是由于 RDL(recursive directional ligation， RDL)技术 [13]的使用而被推向新的高度，其原理如图 1 所示。 使用基因重组合成法，并通过一系列条件优化后， ELPs 的纯化产量可达 克 /升 [17]。 但使用重组的方法合成 ELPs 也有一些缺点：由基因编码的 ELPs 存在 一个很重要的滞后期（ leadtime），这主要是由于需要在理想的载体中对基因进行组装及需要对宿主细胞进行优化表达所导致的 [2]。 图 RDL 技术的分子生物学步骤 [13] The molecular biology steps of RDL[13] 华侨大学硕士研究生毕业论文 5 （续图 ）（ A）人工合成的 ELPs 单体基因插入到克隆载体中。 （ B） ELPs 单体基因序列的两端设计成可被两个限制性内切酶 RE1 与 RE2（即分别为 pflM Ι与 BglΙ）识别的序列。 （ C）分别用 RE1与 RE2 的限制性内切酶酶切含有 ELPs 基因的克隆载体，产生含有 RE1 与 RE2 酶切后粘性末端的片段；用 RE1 酶切含有 ELPs 克隆载体，产生线性克隆载体。 （ D）含有 RE1 与 RE2 酶切后粘性末端的片段与线性载体严格地进行头对尾连接。 （ E）通过此方式，进行新一轮的 ELPs 基因序列延长 [13]。 (A) A synthetic monomer gene is inserted into a cloning vector. (B) The gene is designed to contain recognition sites for two different restriction endonucleases， RE1 and RE2（ pflMΙ and BglΙ respectively）， at each of the coding sequence. (C)An insert is prepared by digestion of the vector with both RE1 and RE2 and subsequently ligated into the vector that has been linearized by digestion with only RE1. (D) The product contains two headtotail repeats of th。