应用ssap技术分析渐渗系后代多样性研究_毕业论文(编辑修改稿)

应用ssap技术分析渐渗系后代多样性研究_毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

子的表达 [15]。 同时许多生物因素，如病毒、细菌、真菌病原物以及真菌提取物接种，也可以导致逆转座子的转录激活 [16,17]。 另外，渐渗杂交也能够诱导逆转座子的转录及转座活性。 逆转座子的转座机制 LTR 逆转座子的转座机制比较复杂，其转座类似逆转录病毒在宿主细胞中的复 制，是逆转录酶主导的反应，以 DNARNADNA 方式转座。 LTR 不编码蛋白质，但含有对转座起重要作用的启动和终止信号。 LTR 逆转座子以其 5’端 LTR 下游的由十几个碱基组成的 mRNA 的引物结合位点（ PBS）与宿主细胞内相应的 tRNA 互补合成短的 RNA 双链，逆转录酶以此 tRNA 为引物合成第一条 DNA 链，与 tRNA 形成 RNADNA 杂合链。 LTR 逆转座子中的 RNaseH 专一地消化 RNADNA 杂合链上的 RNA，形成单链 DNA，然后以此单链 DNA 为模板，位于 3’端 LTR 上游的多嘌呤序列（ PPT）作为引物合成双链线性 DNA 链。 在 INT（整合酶）的作用下，染色体上靶位点的 DNA 双链被切开，同时对将插入的双链 DNA 进行切割，产生 35bp不等的缺痕，合成完毕、具有逆转座子完整结构的双链 DNA 转移到靶位点时，该位点的 DNA 片段两侧形成 35bp 的重复 [18]。 基于逆转座子的 SSAP 分子标记 SSAP 是由 Waugh 等根据 AFLP 标记而改进的一种基于逆转座子 LTR 序列的锚定的 AFLP 技术，用于检测逆转座子插入位点与邻近限制性酶切位点之间的 DNA 多态性（图 2）。 在众多逆转座子的分子标记中， SSAP 被认为是多态性最丰富、灵 8 敏度最高、反映的多态性信息量最多的一种类型。 其原理与操作流程与 AFLP 相类似，首先用限制性内切酶酶切产生具 有粘性末端的限制性片段，然后将这些片段与其末端互补的已知序列的接头相连接，所形成的带接头的特异序列作为随后预扩增反应的模板。 预扩增产物稀释后作为选择性扩增的模板，引物分别为接头特异引物和基于逆转座子中保守序列（如 LTR）而设计的引物。 SSAP 扩增的多态性来源主要有以下三个：第一是限制性位点及其两侧序列的变异；第二是 LTR 5’末端的变异；第三是逆转座子插入位点的变异。 其中第一种变异与 AFLP 所检测的变异一样，而后两种变异则是由逆转座子产生的。 因此，理论上 SSAP 多态性高于 AFLP，目前许多有关 SSAP 和 AFLP 相比较的报道也表明前者多态性高于后者 [19,20,21,22]。 图 2 逆转座子序列特异扩增多态性（ SSAP）扩增原理 Figure 2 Amplification strategy of SSAP (Sequencespecific amplification polymorphism) marker SSAP 分子标记的应用 由于 SSAP 分子标记多态性高 , 操作简单而且费用低等特点 , 利用这种标记进行 9 遗传多样性及种内、种间的系统发育分析对 于亲本选配和品种纯度鉴定具有十分重要的意义。 利用 BARE1 的反向重复序列区设计的 SSAP 引物被应用于小麦四倍体、大麦品种之间的遗传多态性分析以及亲缘关系系统树的构建 ,且通过 SSAP 标记发现了一些常规图谱发现不了的品种间的隐秘变异 [23]。 Venturi 等运用 SSAP 分子标记检测发现苹果新品种的芽变可能是由于逆转座子插入新位点产生。 除此之外 , SSAP 技术还被用于大麦、莴苣等植物 QTLs 定位以及遗传连锁图谱的构建。 本课题的立项依据和研究意义 渐渗杂交是植物界普遍发生的现象，并成为促进植物遗传变异的重 要手段 [24]。 作为栽培稻的祖先，野生稻是一个天然的基因库， 具有高产、优质、强耐冷、抗旱、抗多种病虫害等优良特性 ，前人的研究表明野生稻比栽培稻具有更高的遗传多样性，因此，将野生优异基因转入到栽培种中，是扩大水稻遗传基础和实现水稻遗传改良的重要途径，已经成为国内外育种家孜孜不倦的追求目标。 众多育种工作者构建了一些高代重组自交系，并对一些重要农艺性状的遗传及生理学特性作了大量研究，如耐旱特性的鉴定、耐冷、高产以及茎杆木质化等性状相关基因的 QTL 分析。 然而，目前利用东乡野生稻成功改良栽培稻数量性状的报道仍很少。 研究表明，限制野生种质优异基因利用的原因是多方面的。 一方面是因为野生种中存在不良连锁基因和不利农艺性状，加上所有平衡群体中野生种中不利基因高频的 出现、基因互作的增加、微效多基因效应被掩盖等缺点；另一方面，外源基因渐渗会导致受体植物出现广泛的遗传和表观遗传变化，因而在基因组和表型上表现出许多不稳定现象，如丢失亲本序列或出现新序列；转座子活性等。 这些遗传和表观遗传学变异可在一定程度上导致种间杂种及其后代疯狂分离，并很难在短时间内稳定和纯合，这在一定程度上阻碍了野生优异基因在实际育种中的利用 [25]。 针 对上述制约野生稻种优异基因挖掘和利用的瓶颈问题，本课题组对东乡野生稻基因渐渗系 BC1F9代的 228 个株系进行 SSAP 分析，来揭示渐渗群体的遗传多样性，SSAP 技术够识别出逆转座子插入位点及其附近序列的多样性，对各种植物的遗传图谱构建、基因多态性分析、系统进化树构建、植物进化研究以及由逆转座子导致的基因功能改变分析等方面的研究具有重要意义并为阐明东乡野生稻渐渗诱发栽培稻遗传和表观遗传变异机制奠定基础，为东乡野生稻中优异基因的有效挖掘与利用提供有用的信息。 2 材料与方法 10 供试材料 以东乡野生稻 (O. rufipogon Griff.)为供体亲本 ,与栽培稻协青早 B(O. sativa sp． indica Kato.)杂交获得种间杂种 F1,F1 与协青早 B 回交获得 BC1F1 群体。 BC1F1经单粒传、再连续自交 8 次后获得含 228 个株系的 BC1F9 BILs 群体。 本实验所用 材料 包括东乡野生稻渐渗系后代 BC1F中国水稻品种及国外水稻品种 （表 1）。 表 1 实验材料 Table 1 Materials used in the experiment 品种 Cultivars 名称 name 渐渗系 后代 IL533 IL524 IL1 IL5 IL11 IL12 IL14 IL18 IL15 IL1IL IL22 IL533 IL IL1 IL3 IL8 IL75 中国水稻 空育 13 哈 0 密阳 4 金 23B、 珍汕 97B、 南京 6号 、 台农 1号 、 测 6 桂 9 谷梅 4号 、 日本晴 、 TP30 稻花香 、 XB 国外水稻 K12 、 trenasse 、 wells 、 Bengal 、 Lemont 、 R15 、 242 cocodrie、Ronolo、 Katy、 della、 tempheton、 francis、 dellrose 实验方法 模板 DNA 的制备 所有材料在长至三叶一心时期取幼嫩的叶片 ,采用改良的 CTAB 法提取水稻基因组 DNA[26], 具体步骤如下 : （ 1） 取 3~5 g 水稻幼嫩的叶片剪碎放入研钵中 ,加液氮充分研磨至粉碎 ,适量分装至 2 mL 离心管中 ,装 1/3 左右。 （ 2） 每管加入 1 mL 65℃ 预热的提取液 (CTAB),上下颠倒混匀 ,置 65℃ 水浴锅中温育 30~60 min, 隔 10 min 颠倒混匀一次。 （ 3） 取出室温放置 5 min 冷却 , 加入等体积的氯仿 :异戊醇 (24:1), 缓慢上下颠倒混匀。 （ 4） 室温下 12,000 rpm 离心 10 min (温度不低于 15℃ )， 重复抽提 2 次。 （ 5） 吸取上清液约 600 μL到新的 mL 离心管中 ,加入等体积的预冷的异丙醇 , 轻轻混匀 (沉淀 DNA)后 20℃ 冰柜下 2h 或过夜。 （ 6） 4℃ 下 10,000 rpm 离心 10 min, 弃上清 , 加入 800 μL 70%乙醇漂洗 , 10,000 rpm 离心 5 min, 弃去乙醇溶液 , 重复漂洗一次。 11 （ 7） 弃上清 ,自然晾干后 ,将沉淀的 DNA 溶于 600 μL 的 TE 溶液中 ,放常温下完全溶解。 加入 5 μL不含 DNase 的 RNaseA(终浓度为 100μg/mL),37℃ 保温 2 h。 （ 8） 然后于离心管中加入 600 μL 氯仿 :异戊醇 (24:1), 轻轻上下颠倒混匀 10 min 后 12,000 rpm 离心 10 min,吸取上清液到 mL 的离心管中先后加入 1/10 体积的 3M 醋酸钠 (pH=)和两倍体积预冷的无水乙醇 ,置 20℃ 冰柜中。 （ 9） 2 h后 10,000 rpm离心 10 min,弃上清 ,之后用 70%乙醇漂洗 (8000 rpm,5min, 4℃ ),自然晾干后 ,最后 DNA 溶解 于 100 μL灭菌的 ddH2O 中 ,20℃ 保存备用。 （ 10） 待 DNA 完全溶解以后进行 1%的琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的质量 ,根据DNA marker 估计其溶度 ,调整溶度后的 DNA 置于 20℃ 保存备用。 基因组 DNA 酶切 用限制性内切酶 EcoRI 和 MseI (NEB) 进行酶切反应 ,反应体系如下 : DNA 300ng 10T4 ligase Buffer EcoRI （ 20 U/μL） MseI （ 20 U/μL） ddH2O Up to 注 :酶切反应前 ,先将 DNA、 10T4 ligase Buffer、 ddH2O 混匀 ,4℃放置 30min 后 ,加入内切酶 ,混匀、低速离心数秒 ,37℃温浴。 连接接头 EcoRI 接 头序列为： 5’ CTCGTAGACTGCGTACC3’ 3’ CATCTGACGCATGGTTAA5’ MseI 接头序列为： 5’ GACGATGAGTCCTGAG3’ 3’ TACTCAGGACTCAT5’ 用 T4 DNA ligase（ TaKaRa）进行连接反应，体系如下： DNA 酶切产物 EcoRI 接头 （ 5pmol/μl） MseI 接头 （ 50pmol/μl） 10 T4 ligase Buffer T4DNA ligase（ 5U/μl） ATP（ 10mM） Mg2+（ 25 mM） ddH2O 12 将上述反应物混匀离心数秒 ,37℃保温过夜 ,65℃ /10 min,20℃ 保存备用。 预扩增 反应体系如下： DNA 酶切连接产物 10PCR Buffer Mg2+（ 25mM） dNTP（ mM） Taq 聚合酶（ 5U/μl） l。