不同固定方法对pyk2免疫荧光染色的影响毕业论文(编辑修改稿)

不同固定方法对pyk2免疫荧光染色的影响毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

细胞核的成熟对于卵母细胞恢复减数分裂都很重要，二 者缺一不可。 因此，从 Pyk2 在 GV 期卵母细胞的核中定位来看， Pyk2 可能与染色体的凝集有关。 许多家畜类哺乳动物，如猪、牛、羊等卵母细胞体外培养一般经过较长的时间才能恢复减数分裂（如猪卵母细胞需 1824 小时），在这一段时间里，细胞核内有大量的基因转录，用蛋白质合成抑制剂放线菌酮处理卵母细胞可以抑制 GVBD 的发生，但是小鼠卵母细胞体外成熟时间很短， 12 小时即可发生 GVBD，并且蛋白质合成抑制剂并不能阻止该过程发生。 那么，小鼠卵母细胞核在体外培养的短暂时间内除了蛋白质凝集是否还具有其它功 能，比如转录，至今还不清楚。 但是在体细胞的研究中发现， Pyk2 存在核转位现象，和细胞核的转录功能相关。 在体外培养 4 的皮肤角质细胞中， Pyk2 也被发现定位在细胞核中，它的活化可以提高 Fra1 和 JunD 两个转录因子的活性，通过调节基因转录参与角质细胞的分化。 以往的研究表明，在小鼠卵母细胞的生发泡中检测到许多在减数分裂中具有重要功能的酶，如磷酸化的PKC，因此我们进一步探究 Pyk2 蛋白在小鼠胚胎发育过程中的定位，及相关功能。 卵母细胞固定和压片技术 固定剂有多聚甲醛 ( paraformal dehyde, PFA )及有机溶剂乙醇 、甲醇 、丙酮 等几种 , 其中以 PFA 最为常用 [15]。 PFA 的工作原理是 : 甲醛与蛋白质的氨基发生反应 , 使蛋白质凝固 , 降低蛋白质的水溶性 , 保持细胞结构完整。 常用的渗透剂为表面活性剂 Triton X100, 它可以使脂质细胞膜的通透性增强 , 使大分子抗体易于进入细胞内与抗原特异性结合 [11]。 曾经有人为了 探索有效的染色前固定及渗透卵母细胞的方法 , 以提高小鼠卵母细胞免疫荧光染色的效率 [17]。 他们在实验中 采用 了 4种不同的固定及渗透方法处理小鼠卵母细 胞 的方法。 方案 A: 先用 4%多聚甲醛 ( PFA)固定 1 h, 再用 0. 5% Triton X— 100穿透 10 m in。 方案 B: 先用 0. 5% Triton X— 100穿透 10 m in, 再用 4% PFA 固定 1 h。 方案 C: 用 1% PFA + 0. 5% Triton X— 100同时固定与穿透 1 h。 方案 D: 用 20预冷甲醇固定 15 m in。 分析 10种核蛋白 ( TFⅡ A、 TFⅡ B、 TAF TAF polⅢ、 BRF M eCPMBD2ab、 HP1α及 HP1β )在小鼠卵母细胞中的免 疫荧光染色效果。 他们发现 只有方案 C 能够完全检测出这 10种蛋白质。 于是他们得出的结论是 用 1% PFA +% Triton X— 100同时固定与穿透 1 h, 可以在小鼠卵母细胞形态保持良好的同时检测出更多的蛋白质[12]。 卵母细胞的固定、染色及 制 片对于研究卵母细胞的形态、结构很重要 , 但一直以来单细胞固定、染色是实验研究中的技术难点 [13]。 因为普通的单个细胞 , 特别是卵母细胞在固定过程中容易丢失 ,而且细胞体积过大 , 在 制 片过程中容易导致细胞破裂。 所以单细胞固定、染色及 制 片的方法显得尤为重要 [14]。 对于体内体积最大的卵母细胞 , 它不能用普通细胞免疫组织化学方法完成固定、染色及 制 片的原因如下 : ① 卵母细胞体积较大 , 数量稀少 , 受精前停留在第二次减数分裂中期 , 不能爬片生长 , 因此也就不能像普通体细胞那样制作细胞爬片。 而且细胞悬液滴到玻片上时同样会有卵母细胞的丢失 ,并且因为卵母细胞体积大 , 体表面积与容积比率大 ,细胞在滴片过程中容易碎裂 , 因此很难将卵母细胞固定于玻片上。 为了解决这些问题 , 目前 在实验中采用了液滴培养法 , 即卵母细胞固定及染色的操作步骤均在液滴中进行 , 在显微镜下通过毛细玻璃管在液滴 内移动细胞、洗涤细胞 , 避免了卵母细胞的丢失和破碎。 ②因为卵母细胞不 5 易固定于玻片上 ,因此卵母细胞的固定过程不能像普通体细胞那样漂洗。 ③ 普通体细胞体积小 , 脱水之后体积更小 , 故压片过程中不存在破裂问题 , 但卵母细胞体积较大 ,压片过程中容易破裂 , 目前 采用封片胶制作成长方体小柱 , 分别置于液滴的正对盖玻片的 4个角上 , 用于分担盖玻片的压力 , 有效地避免了这个问题 [15]。 液滴法和点柱法虽能有效地解决卵母细胞固定、染色及 制 片中存在的问题 , 但在实际操作过程中 , 仍需注意以下 2 点 : ① 制 片过 程中含有卵母细胞的 抗荧光淬灭剂液滴大小要适中 , 液滴过大不易于扫描观察 , 液滴过小压片过程中容易压破卵母细胞 , 故液滴大小很重要 [16]。 通过实验证实 , 2~3 μ l大小的液滴 , 在盖玻片盖下时正好不会溢出盖玻片的面积 , 并且整个盖玻片都可以被液滴浸润 , 有效的避免了卵母细胞的丢失。 ② 用于分担盖玻片压力的小柱大小要适中 , 太高会影响盖片后的扫描观察 ,太低又起不到分散压力的作用 , 小柱的大小要在实验中不断调试。 如果做好了这 2 点 , 卵母细胞的固定及压片将不再困难。 本研究 采用 2组不同的固定剂与渗透 剂的组合方案 , 以 402位点磷酸化的 pyk2蛋白为研究对象 , 通过免疫荧光技术检测其在二细胞小鼠胚胎细胞成熟过程中的精确分布情况 , 以期优选出一种快速、简捷、高效的小鼠胚胎细胞固定和渗透方法。 6 2 实验 材料 2. 1 实验动物 ICR 小鼠 , 雌 鼠 6~ 8 周龄 , 体质量约 2030g,雄鼠 12 周龄。 购自 北京维通利华 实验动物中心。 买回后自由取食饮水，在 12h 光照， 12h 黑暗的条件下适应性饲养一周。 小鼠的饲养房要保持室外整洁，墙壁、门窗、地面等无尘土，无蜘蛛网，最 好是室内每月用 ％的新洁尔灭喷雾消毒 1次，室外用 3％来苏尔消毒一次。 鼠架每周要用消毒药液的湿布擦洗一次。 垫料要保持清洁和干燥，放在专用的房间贮存，严格防止猫、野鼠、狗等窜入。 2. 2 实验器材 注射器、一次性手套、大、小镊子剪刀各一套、酒精棉球、一次性平皿（大、小）、玻璃针、载玻片、盖玻片、记号笔、四孔皿、 湿盒、暗盒、（ 1ml、 200μ l、 20μ l、10μ l、 l）移液器、遮光片、大小 EP管、尖头镊子、 解剖盘、解剖刀 2. 3 实验 药品 PMSG、 HCG：购自浙江宁波三生药业有限公司 G1培养液：购自 Vitrolife公司 一抗 ： （ Abcam牌子的 Anti PYK2（ phospho Y402） antibody 402位点磷酸化的 PYK2蛋白的抗体） 二抗 ： （ FITC标记的羊抗兔 lgG（ H+L).ZF0311） 碘化丙啶 （ PI） 、抗荧光猝灭剂、甘油、 NaCl、 KCl、 Na2HP、 KH2PO PFA。 以上实验药品如无特殊提均购自美国 Sigma 公司。 2. 4 试剂 配制 （ 1） 常规 固定液： 称取 （ PFA） 加入 中加热到 50度然后加入7μ l NaOH助溶 ，冷却到室温再加 （固定液现配现用，一周更换一次） （ 2） 改进固定液配制：取 100μ l常规固定液加入 1μ l 10的 Triton X100 （ 3） 孵育液： 配制时称取 MgCl２ •6H NaCl、 0,477g Hepes、 蔗糖、。