生物化学蛋白质章节考点总结(编辑修改稿)

生物化学蛋白质章节考点总结(编辑修改稿)内容摘要：

１３ （三） αNH2和 αCOOH共同参加的反应 与茚三酮反应 茚三酮在弱酸中与α 氨基酸共热，引起氨基酸的氧化脱氨，脱羧反应，最后，茚三酮与反应产物 ——氨和还原茚三酮反应，生成紫色物质。 （ λmax=570nm） 图 定性、定量。 （四） 侧链 R基参加的反应 —— 用于蛋白质的化学修饰 （不作要求，只提一下，《陶慰孙》第四章） 七、 氨基酸的分离和分析 电泳分离 电泳的基本原理 举例： Glu、 Leu 、 His 、 Lys， 4 种混合样，在 时，泳动方向及相对速度。 Glu Leu His Lys pI 图 滤纸层析和薄层层析 分配原理 离子交换层析分离氨基酸 磺 酸型阳离子交换树脂 图 树脂先用含 Na 的缓冲液处理成钠盐，且 pH 在 2 左右，将氨基酸混合液（ pH23） 上柱，氨基酸此时是阳离子，与树脂上的钠离子交换，被固定在树脂上。 作用力：（ 1）静电吸引，（ 2）氨基酸侧链与树脂基质 (聚苯乙烯 )的疏水作用力 氨基酸分析仪   rG qR １４ 第三节 肽 peptide 一、 肽和肽键的结构 肽： 是由一个氨基酸的羧基和另一个氨基酸的氨基脱水缩合而成的化合物。 肽键： 氨基酸间脱水后形成的共价键称肽键（酰氨键），其中的氨基酸单位称氨基酸残基。 由两个氨基酸形成的肽叫二肽， 少于 10 个氨基酸的肽叫寡肽， 多于 10 个氨基酸的肽叫多肽。 结构： P111 上 5 肽 主要重复单位： 侧链Ｒ：由不同的氨基酸残基构成 名称：丝氨酰甘氨酰酪氨酰丙氨酰亮氨酸 写法： Ｎ SerGlyTryAlaLeu 或ＳＧＹＡＬ，如果倒过来写，则表示不同的肽，如Leu—AlaTyrGlySer。 肽键的结构特点： （ 1）酰胺氮上的孤对电子与相邻羰基之间的共振作用，形成共振杂化体，稳定性高。 （ 2）肽键具有部分双键性质，不能自由旋转，具有平面性。 图 P111 下 肽键结构 结构１中，Ｃ－Ｎ单键长 结构２中，Ｃ＝Ｎ双键长０ .127nm 结构３中，Ｃ Ｎ键长 ，６个原子几乎处在同一平面内 （酰氨平面）。 肽键结构介于１和２之间（结构 3），是结构 1和结构 2之间的平均中间状态。 Ｃ－Ｎ单键具有的 40%的双键性质， C═O 双键具有 40%的单键性质。 （ 3）肽键亚氨基在 pH014 内不解离。 （ 4）肽链中的肽键一般是反式构型，而 Pro 的肽键可能出现顺、反两种构型． 图 二、 肽的重要性质 旋光性 一般短肽的旋光度等于其各个氨基酸的旋光度的总和。 蛋白质水解得到的各种短肽，只要不发生消旋作 用，也具有旋光性。 肽的酸碱性质 短肽在晶体和水溶液中也是以偶极离子形式存在。 在 pH0― 14 范围内，肽键中的亚氨基不解离，因此肽的酸碱性质主要取决于Ｎ端 α－ＮＨ ２ 和Ｃ端 α－ １５ COOH 以及侧链Ｒ上可解离的基团。 在长肽或蛋白质中，可解离的基团主要是侧链基团。 肽中的末端 α－ COOH pK 值比游离 中的大一些，而末端 α－Ｎ ＋ Ｈ ３ 的 pK 值比游离氨基酸中的小一些， R 基变化不大。 pK 值改变的原因： 见Ｐ 11表３－８，比较表３－８中 GlyGly 和 GlyGlyGly Gly—Glu—Lys—Ala 的解离： 图 P113 pH 占优势离子的净电荷： +2 +1 0 1 2 注意：占优势离子的净电荷不是全部离子的平均净电荷。 问题 1： 求出二肽 Lys—Lys 及三肽 Lys—Lys—Lys 的 pI 值。 图 将Ｒ ＋＋ — 变成Ｒ ＋ — ，就必须考虑 R＋ — 与 R（ + ， + ， 1）等同，即侧链 — N+H3解离 50%，此时 图 LysLysLys 分子中有三个侧链可解离，它的 R+实际相对于 R（ + ， + ， + ， 1 ），此时每个侧链解离后带有 1/3 个正电荷。 问题 2： 把一个氨基酸结晶加入 的纯水中，得到 的溶液，此氨基酸的 pI 值是大于。 小 于 ? 还是等于。 （小于 ） 多肽的等电点，随着肽链内酸性氨基酸残基数的增加而下降，随着肽链内碱性氨基酸残基数的增加而上升。 多肽的等电点可以通过计算求得（如上例中），但残基数增大时，此法不行。 可将肽链内酸性残基和碱性残基进行清点比较， 推测等电点偏酸还是偏碱，然后用等电点聚焦电泳进行实验测定。 肽的化学反应 和游离氨基酸一样，肽的 α— 羧基， α— 氨基和侧链 R 基上的活性基团都能发生与游离氨基酸相似的反应。 凡是有肽键结构的化合物都会发生双缩脲反应，且可用于定量分析。 双缩脲反应是肽和蛋白质特有的反应，游离氨基酸无此反应。 图 21 213131 31 １６ 三、 天然存在的活性肽 生物体内存在大量的多肽和寡肽，其中有很多具有很强的生物活性，称活性肽。 生物的生长、发育、细胞分化、大脑功能、免疫、生殖、衰老、病变等都涉及到活性肽。 活性肽是细胞内部、细胞间、器官间信息沟通的主要化 学信使。 很多激素、抗生素都属于肽类或肽的生物。 谷胱甘肽 Glu— Cys— Gly 广泛存在于动、植、微生物细胞内，在细胞内参与氧化还原过程，清除内源性过氧化物和自由基，维护蛋白质活性中心的巯基处于还原状态。 2GSH GS— SG H2O2 + 2GSH 2H2O + GS— SG 短杆菌肽（抗生素） 由短杆菌产生的 10 肽环。 抗革兰氏阳性细菌，临床用于治疗化浓性病症。 LOrn— LLeu— DPhe— LPro— LVal— LOrn— LLeu— DPhe — LPro— LVal 脑啡肽（ 5 肽） 已发现几十种 Met 脑啡肽： Tyr—Gly— Gly— Phe— Met Leu脑啡肽： Tyr— Gly— Gly— Phe— Leu 具有镇痛作用。 1982 年，中科院上海生化所用蛋白质工程技术合成了 Leu脑啡肽，既有镇痛作用又不会象吗啡那样使人上瘾。 《神经生物化学》 神经多肽 生物体内多肽或寡肽的来源： ①合成蛋白质的剪切、修饰 ②酶专一性逐步合成（如谷胱甘肽）、 ③动 物肠道可吸收寡肽 第四节 蛋白质的一级结构（共价结构） 蛋白质的一级结构也称共价结构、主链结构。 一、 蛋白质结构层次 一级结构（氨基酸顺序、共价结构、主链结构） ↓ 是指蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 二级结构 ↓ １７ 超二级结构 ↓ 构象（高级结构） 结构域 ↓ 三级结构 (球状结构 ) ↓ 四级结构 (多亚基聚集体 ) 一级结构： 共价结构、蛋白质分子中氨基酸残基的排列顺序 (含二硫键 ) 二级结构： 多肽链主链中各个肽段形成的规则的或无规则的构象。 主要有 α 螺旋、β折叠、β 转角、无规卷曲。 超二级结构： 由两个以上二级结构单元相互聚集形成的有规则的二级结构的组合体如 αα 、β α β、βββ。 结构域： 大的球蛋白分子中，多肽链形成几个 紧密的球状构象，彼此分开，以松散的肽链相连，此球状构象是结构域，结构域是多肽链的独立折叠单位，一般由 100200 个氨基酸残基构成。 三级结构： 多肽链通过盘旋、折叠，形成紧密的借各种次级键维持的球状构象。 或：蛋白质分子或亚基内所有原子的空间排布，不含亚基间或分子间的空间排列关系。 四级结构： 寡聚蛋白中亚基种类、数目、空间排布及亚基间相互作用力。 单链蛋白质只有一、二、三级结构，无四级结构。 RNase 单条肽链 肌红蛋白 单体蛋白 胰岛素 多条肽链 胰凝乳蛋白酶 蛋白质 相同亚基 一种乳酸脱氢酶 α 4 寡 聚蛋白 不同亚基 血红蛋白 α 2β 2 蛋白质一级结构 (序列 )中含有形成高级结构的全部需的信息，一级结构决定高级结构结构及功能。 二、 一级结构的要点 蛋白质主链由氨基酸以酰胺键连接，多肽的线性结构叫肽链，组成肽链的氨基酸叫氨基酸残基。 一级结构要点： ⑴蛋白质中的肽键都是由 αNH2和 αCOOH 结合生成的。 ⑵每一种蛋白质都有相同的肽主链结构，各种蛋白质间的差异是蛋白质的氨基酸种类、数量及排列顺序不同。 ⑶氨基酸的 α NH2和 α COOH 缩合，只有末端及侧链基团有化学活性。 ⑷每个蛋白质或每个蛋白质的亚基只有一个 α NH2 和 α COOH ⑸分子量大于 5000 的活性肽才能称为蛋白质。 三、 ．蛋白质一级结构测定 １８ 推断 预测 氨基酸序列（一级结构） → 空间结构 （高级结构） → 功能 （一） 蛋白质测序的一般步骤 祥见 P116 （ 1） 测定蛋白质分子中多肽链的数目。 （ 2） 拆分蛋白质分子中的 多肽链。 （ 3） 测定多肽链的氨基酸组成。 （ 4） 断裂链内二硫键。 （ 5） 分析多肽链的 N 末端和 C 末端。 （ 6） 多肽链部分裂解成肽段。 （ 7） 测定各个肽段的氨基酸顺序 （ 8） 确定肽段在多肽链中的顺序。 （ 9） 确定多肽链中二硫键的位置。 （二） 蛋白质测序的基本策略 对于一个纯蛋白质，理想方法是从 N 端直接测至 C 端，但目前只能测 60 个 N 端氨基酸。 直接法（测蛋白质的序列） 两种以上特异性裂解法 N C A 法裂解 A1 A2 A3 A4 B 法裂解 B1 B2 B3 B4 用两种不同的裂解方法，产生两组切点不同的肽段，分离纯化每一个肽段，分离测定两个肽段的氨基酸序列，拼接成一条完整的肽链。 间接法（测核酸序列推断氨基酸序列） 核酸测序，一次可测 600800bp （三） 测序前的准备工作 蛋白质的纯度鉴定 纯度要求， 97%以上，且均一，纯度鉴定方法。 （两种以上才可靠） ⑴聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)要求一条带 ⑵ DNS— cl（二甲氨基萘磺酰氯）法测 N 端氨基酸 测定分子量 用于估算氨基酸残基 n= 方法：凝胶过滤法、沉降系数法 110mw １９ 确定亚基种类及数目 多亚基蛋白的亚基间有两种结合方式： ⑴非共价键结合 8mol/L尿素， SDS SDSPAGE 测分子量 ⑵二硫键结合 过甲酸氧化： — S— S— +HCOOOH → SO3H β巯基乙醇还原： 举例 :： 血红蛋白 (α 2β 2) （注意，人的血红蛋白 α 和β的 N 端相同。 ） 分子量： M。