第四章生产中常用菌种的分离、选育和保藏(编辑修改稿)

第四章生产中常用菌种的分离、选育和保藏(编辑修改稿)内容摘要：

吸取 MNNG溶液 lml，加入到 1m1孢子悬液中， 30℃ 振荡 30min，立即稀释 1000倍停止作用，然后以 102， 104两个稀释度分离培养，30℃ 3天后计数。 4．死亡率计算 将未处理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸缓冲液中，同上逐级稀释分离， 30℃ 下培养 3天。 根据处理前后的活孢子数可计算出死亡率。 5．挑取菌落进行糖化酶及蛋白酶产量筛选． 第五节 营养缺陷型的选育 • 营养缺陷型是指通过诱变而产生的缺乏合成某些营养物质如氨基酸 、 维生素和碱基等的能力 ，必须在其基本培养基中加入相应的营养成分才能正常生长的变异株。 • 与营养缺陷型对应的是野生型。 • 能满足野生型菌株正常生长的培养基称基本培养基 (MM)； • 在基本培养基中加入相应的营养成分的称补充培养基 (SM)； • 能满足各种营养缺陷型生长的称完全培养基(CM)， 如牛肉膏蛋白胨培养基 、 麦芽汁培养基等。 营养缺陷型的用途 • 营养缺陷型在生产上和科学研究上用途很大。 目前生产氨基酸 、 核苷酸的菌种都是各种类型的缺陷型。 要研究代谢途径 ， 育种技术都必须有营养缺陷型的菌株为材料。 筛选营养缺陷型的步骤 • 诱变 • 淘汰野生型 • 检出缺陷型 • 确定生长谱 一、诱变方法 • 物理诱变 • 化学诱变 二、淘汰野生型 • 抗生素法：野生型能在 MM中生长 ， 而缺陷型不能 ， 于是将诱变处理液在 MM中培养短时让野生型生长 ， 处于活化阶段 ， 而缺陷型无法生长 ， 仍处于休眠状态。 由于细菌或酵母对一些抗生素敏感 ， 于是就相应加入一定量的抗生素 ，结果活化状态的野生型就被杀死 ， 保存了缺陷型。 一般细菌可以采用青霉素 ， 酵母可采用制霉菌素。 • 菌丝过滤法：对于霉菌 ， 因孢子生长后会长出菌丝体 ， 就可用滤纸过滤法将菌丝滤去 ， 而缺陷型孢子却因未发芽而不能滤过。 三、检出缺陷型 • 原理：在固体基本培养基和完全培养基上 ， 生长情况完全不同 ， 缺陷型在 CM上生长良好 ，而在 MM上则不生长 ， 野生型都能生长。 • 具体方法：影印法、点种法、夹层法 • 1． 将一较平皿直径小 1cm的金属圆筒蒙上一层灭菌的丝绒 ， 用金属夹夹住 ， 灭菌。 • 2． 将完全培养基上长出的全部菌落在丝绒上轻轻一压 ， 使之成为印模 ， 标记方位。 • 3． 将基本培养基平皿和完全培养基平皿在标记的同一方位上先后轻轻一压 ， 此菌印模即复印于上。 (一 )影印法 • 4 ． 将 CM和 MM在恒温箱中培养。 • 5． 二平皿相同方位进行比较 ， 即可发现在MM平皿上长出的菌落少于 GM平板上的。 MM上未长而相应于 CM上长出的那几个菌落就可能是缺陷型。 • 此法要求平皿上菌落不能太多 ， 菌落之间应有一定间隔。 (二 )点种法 • 也就是任意法。 • 用接种针或牙签将 CM上长出的菌落在 MM和CM两副平板上接种 ， 依次在相应位置点种 ，然后一起培养 ， 观察其生长情况。 • 此法结果明确 ， 但工作量大。 (三 )夹层法 • 先在培养皿上倒一层基本琼脂培养基 ， 凝固后涂上一层含菌的 MM， 凝固后再倒一薄层 MM琼脂培养基 ， 培养 24h， 将出现的菌落标记 ，然后倒上一层 CM琼脂培养基 ， 再培养。 这时第二批长出的菌落就可能是缺陷型。 • 此法缺点是 ， 结果有时不明确 ， 而且将缺陷型菌落从夹层中挑出并不很容易。 四、营养缺陷型生长谱的确定 • 验证确定是缺陷型后 ， 就需确定其缺陷的因子 ， 即生长谱测定。 生长谱测定的方法 • 将缺陷型菌株培养后 ， 收集菌体 ， 制备成细胞悬液 ， 与 MM培养基 (融化并凉至 50℃ )混合并倾注平皿。 待凝固后 ， 分别在平皿的 5～ 6个区间放上不同的营养组合的混合物或吸饱此组合营养物的滤纸圆片。 培养后会在某组合区长出 ， 就可测得所需营养。 — 个平皿测一个菌。 • 以不同组合的营养混合物与融化凉至 50℃ 的 MM培养基混合铺成平皿 ， 然后在这些平皿上划线接种各个缺陷型菌株于各相应位置 ， 培养后根据在这些组合长出可推知其营养因子。 在 5～ 6个平皿上可测 20株菌以上。 第六节 基因育种 • 基因重组育种：是运用体外 DNA各种操作或修改手法获得目的基因 ， 再借助于病毒 、 细菌质粒或其他载体 ， 将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达 ， 或者通过细胞间的相互作用 ， 使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另 — 个细胞的方法。 一个完整的基因克隆过程包括以下步骤 • １ 、 获得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ； • ２ 、 目的基因与载体在体外连接； • ３ 、 重组 DNA分子导入宿主细胞； • ４ 、 筛选 、 鉴定阳性重组子； • ５ 、 重组子的扩增与／或表达。 基因重组 一、质粒的特点 质粒的存在并非微生物生命活动必需。 每个细胞中存在的质粒数称为该质粒的拷贝数。 不同类型的质粒其拷贝数各异 ， 同一质粒在不同条件下 ， 拷贝数也可能差异很大 ， 有严紧型和松弛型两种。 质粒 DNA分子常呈现三种形态；常见的一种是共价 、 闭环状 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —条链有缺口而产生的开环 DNA(ocDNA)；第三种是由双环分子两段均断裂而产生的线性 DNA。 质粒载体 二、各类质粒所赋予宿主细胞的不同表现型 抗生素抗性：抗生素的产生；大肠杆菌素的产生；肠毒素的产生；复杂有机化合物的降解；限制性核酸内切酶和修饰酶的产生；杀伤性能。 在自然条件下，许多质粒可经细菌接合或相似方式在宿主间相互转移。 在实验室条件下，质粒也可经人工手段将其转化入宿主细胞内。 三、质粒 DNA的提取方法 • 细菌培养和质粒扩增； • 细菌的收获和裂解； • 质粒 DNA的提取。 四、遗传转化 转化是指受体细胞直接摄取供体细胞游离的DNA片段，将其同源部分进行碱基配对，组合到自己的基因中，从而获得供体细胞的某些遗传性状。 (二 )操作步骤： 质粒 DNA转化感受态大肠杆菌 1．从琼脂平板上挑取新鲜菌落接入 10ml肉汤培养基中， 37℃ 培养过夜。 2．取 50ml肉汤中，无菌添加 ／ LMgCl2，于 37℃ 振荡培养。 3．将 ／ L CaCl2溶液、试管及吸管在冰浴中冷却。 4．当培养物 OD600在 ～ ，开始收获细胞 (大约需 2～ )． 5．将培养物置冰浴中冷却 10min。 6．取 10ml培养物置 2个冷离心管中弃去上清液。 7．加入 1ml ／ L CaCl2，再加 CaCl2，置冰浴中放置 20min。 8． 3000r／ min离心 10min，弃去上清液． 9．加入 1ml ／ L CaCl2，重新悬浮细胞，置冰浴中保存。 10．加入 1～ 20μ l待转化质粒 DNA溶液。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 处理 2min。 再插入冰中．加入 37℃ 静置培养 90min。 12．以不同的量涂布选择培养基平板。 13．于 37℃ 培养过夜。 鉴定转化菌落。 常用的遗传转化系统 • 自然系统 • 人工诱导（完整细胞） （ 1）二价阳离子系统： Ca2+， Ca2++Mg2+， Mg2+，Ca2++辅助噬菌体， Tris+Ca 2+ （ 2）单价阳离子系统： PEG+Li+/Cs+/Rb+ （ 3）冻融系统 （ 4） Triton处理：人工诱导（ PEG/原生质体） 重组 DNA中常用的工具酶 • 包括限制性核酸内切酶 、 DNA连接酶 、DNA聚合酶 、 逆转录酶等 . 限制性内切酶 • 切开 DNA分子所需的酶：每一种酶都有其各自的作用位点。 • 常用限制性内切酶 • 种类及特性 W. Arber,H. O. Smith 限制性内切酶的剪切方式 • 粘性未端：切开后的两段 DNA各留下一个尾 ，这 2个尾的核苷酸顺序完全一样 ， 中是方向相反。 它们之间是互补的 ， 在适当条件下可以再连接一起。 其它工具酶 • 连接酶 T4 DNA • 修补工具酶 DNA聚合酶 I • 末端加工酶 S1核酸酶 ， 碱性磷酸单脂酶 • 末端转移酶 人工加 polyA 或 polyT 尾 • 反转录酶 载体－宿主系统 • 载体 (vector)是携带外源 DNA进入宿主细胞进行扩增和表达的 DNA； • 一般是通过改造质粒 、 噬菌体或病毒等构建的。 载体应具备以下条件： • １、能在适当的宿主细胞中复制； • ２、具有多种限制酶的单一切点（即所谓多克隆位点）以便外源 DNA插入； • ３、具有筛选标志以区别阳性与阴性重组分子； • ４、载体分子较小，以便体外基因操作，同时载体 DNA与宿主 DNA便于分离； • ５、对于表达型载体还应具有与宿主细胞相适应的启动子、增强子、加尾信号等基因表达元件。 宿主细胞必须符合以下条件 • １、对载体的复制和扩增没有严格的限制； • ２、不存在特异的内切酶体系降解外源 DNA； • ３、在重组 DNA增殖过程中，不会对它进行修饰； • ４、重组缺陷型，不会产生体内重组； • ５、容易导入重组 DNA分子； • ６、符合重组 DNA操作的安全标准。 目的基因的获取 • 一、通过建立基因文库分离靶基因 • 基因文库包括两类：基因组文库：利用限制性内切酶。 • cDNA：用 mRNA反转录成单链 DNA，再经 DNA聚合酶的作用产生双链 DNA。 可去除真核生物基因中不表达的内含子。 • 二、化学合成法制备 DNA片段 • 从蛋白质肽链的氨基酸顺序可以知道它的遗传密码，再依照密码合成基因。 • 三、聚合酶链反应法扩增基因片段 • 对于已知全部或部分核苷酸序列的基因，可以通过聚合酶链反应（ＰＣＲ），以基因组 DNA或 cDNA模板扩增得到目的基因片段。 PCR技术 • 根据需扩增片段的两端设计引物。 • 使 DNA解链（高温），引物结合于基因的两端（低温），在合适温度下开始合成（链延长）反应。 • 特点：需要很少的 DNA模板，且能直接从基因组中得到目的基因。 DNA扩增 PCR反应 DNA片断的克隆 载体的条件 ： a 复制起点 b 适宜的限制酶切点 c 选择标记 • DNA分子的体外连接 DNA片段的体外连接是重组 DNA技术的关键。 DNA连接是由 DNA连接酶催化完成的。 一、 DNA连接酶 • DNA连接酶催化两条双链 DNA片段相邻的 5’磷酸和 3’羟基间形成磷酸二酯键。 • 在分子克隆中最有用的的 DNA连接酶是来自Ｔ４噬菌体的 DNA 连接酶。 • T4 DNA连接酶在分子克隆中主要用于： • １ 、 连接具有同源互补粘性末端的ＤＮＡ片段； • ２ 、 连接双链 DNA分子间的平端； • ３ 、 在双链平端的 DNA分子上添加合成的人工接头或适配子。 重组 DNA导入宿主菌 • 体外连接的重组 DNA分子必须导入适当的受体细胞中才能大量的复制 、 增殖和表达。 根据所采用的载体的性质 ， 将重组 DNA分子导入受体可有不同的方法。 一、转 化 • 指以细菌质粒为载体 ， 将外源基因导入受体细胞的过程。 转化时 ， 细菌必须经过适当的处理使之处于感受态－即容易接受外源 DNA的状态 ，然后利用短暂热休克使 DNA导入细菌。