β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化毕业论文(编辑修改稿)

β-半乳糖苷酶_酶活性_酶的固定化毕业论文(编辑修改稿)内容摘要：

了依据。 1972 年 Rlun 等报道了真菌 β半乳糖苷酶的特性。 进入 80 年代，Jrodon 等 [4]首次对小鼠成功的获得了动物基因转移，是纯合子动物分泌的乳汁中完全不含乳糖，为利用基因工程生产低乳糖牛乳奠定了基础。 国内对 β半乳糖苷酶的研究起步较晚，是在 20世纪 80年代以后开始的。 1980年 天津工业微生物研究所 [5]组成 β半乳糖苷酶研究组，对 β半乳糖苷酶产生菌的选育、发酵工艺研究、酶的提取纯化、酶学特性的进行了较为全面的研究。 1990年无锡轻工业大学的李强军等选育到黑曲霉菌 CWL2NU3，经发酵条件优化后产酶活 力达 12u/ml（ ONPG 单位）。 1985 年东北农业大学的万贤生对 β半乳糖苷酶在乳清中的综合利用展开了研究。 上海复旦大学的郭杰炎等以乳酸酵母 Y121发酵生产的 β半乳糖苷酶活力达 40u/ml（ ONPG 单位），干燥制成的酶粉冰箱保藏半年，酶活残存 98%。 目前， β半乳糖苷酶主要用于低乳糖制品的研制和开发，以满足乳糖不耐症患者对乳制品消费的需求。 工业 生产 上最直接、有效的方法就是将酶直接加入到牛乳中制得乳糖水解乳，该法水解条件温和（ ~8，温度 50~60℃ ），产物简单，不会破坏乳中的其他营养成分。 国 外已有一 些 大公司生产商业用乳糖酶制剂，用于生产乳糖水解乳制品。 随着研究的不断深入，微生物发酵法生产的 β半乳糖苷酶活性会进一步得到提高。 如果在国内能够实现 β半乳糖苷酶 的工业化生产，其制品的生产和应用成本将会大幅度降低。 因此， β半乳糖苷酶具有广阔的市场前景，并且会取得相当可观的经济效益和社会效益。 东北电力大学学士毕业论文 4 β半乳糖苷酶的来源及其特性 β半乳糖苷酶存在于植物（尤其是杏、桃、苹果），细菌（大肠杆菌、乳酸菌等），真菌（米曲霉、黑曲霉、脆壁酵母、乳酸酵母、热带假丝酵母等），放线菌以及哺乳动物（特别是婴儿）的 肠道中。 目前仅来源于微生物的 β半乳糖苷酶有工业应用价值，利用微生物发酵法制取 β半乳糖苷酶，酶源丰富，产量高，生产成本低，周期短，而且不受季节、地 理位置等因素的影响。 不同微生物来源的β半乳糖苷酶 的性质有所不同 [6]。 细菌产生的 β半乳糖苷酶 细菌 β半乳糖苷酶，尤其是嗜热细菌产生 的酶正 得到广泛的研究，到目前为止，大肠杆菌（ Escherichia coli）产生的 β半乳糖苷酶是研究的最彻底、最深入，并已大量用于生化分析中。 细菌产生的 β半乳糖苷酶是 胞内酶 ，在培养过程中不能分泌到培养基中，它 的耐热性较高，这一点有利于固定化酶的制造。 但因产量低及可能的毒性问题，故迄今未用于工业化生产。 酵母菌产生的 β半乳糖苷酶 酵母菌产生的 β半乳糖苷酶通常是胞内酶，制备纯品必须破碎细胞，该酶对酸、热较不稳定，当某些离子存在时，才有最大活性，因此不适于在工业上进行应用。 但是，酵母菌容易培养，在深层培养条件下可以大量生产 β半乳糖苷酶，这些优点掩盖了它的不足，故酵母菌产生的 β半乳糖苷酶才得以成功的进行开发。 酵母菌产生的 β半乳糖苷酶最适 pH 近于中性，与牛乳的天然 pH 值 接近 ，最适温度较低， 适于 处理牛 乳和甜乳清中的乳糖。 脆壁酵母和乳酸酵母（ Saccharimyces lactic）是生产 β半乳糖苷酶的主要酵母菌种。 霉菌产生的 β半乳糖苷酶 霉菌产生的 β半乳糖苷酶是 胞外酶 ，可以用固态培养也可以采用液态深层培养来生产，在培养过程中酶分泌到培养基中，提取较为方便。 霉菌产生的 β半乳第 1 章 绪 论 5 糖苷酶较耐热、耐酸，不需要活化剂和稳定剂，稳定性较高。 等人发现，米曲霉产生的 β半乳糖苷酶即使在 45℃ 高温下贮藏 6 个月，仍能保存其活力的 %。 曲霉 β半乳糖苷酶的最适 pH 值较低，适用于 面 包 的制造以 及 分解面团中的乳糖 ， 有利于酵母发酵，并使制品具有良好的色泽。 同时，由于 它 较为稳定，有很好的耐受性，比 酵母 β半乳糖苷酶更适合于固定化酶的制造。 目前应用较多的霉菌 β半乳糖苷酶产生菌主要是米曲霉（ Aspergillus oryzse）和黑曲霉（ Aspergillus niger）。 β半乳糖苷酶在食品工业中的应用 水解牛乳和其它乳制品中的乳糖 解决乳糖不耐症患者的乳品消费问题 牛乳中含有丰富的蛋白质、脂肪、碳水化合物以及几乎全部已知的维生素，尤其是牛乳中含有丰富 的钙质，且极易被人体吸收，被誉为 “ 近乎完善的食物 ”。 但据有关资料报道，有 10％的白人， 51％的印第安人， 81％的非裔加勒人和 70％的亚洲人由于肠道内缺乏 β半乳糖苷酶而患有程度不同的乳糖不适症 (又称乳糖不耐症 )[7]。 用 β半乳糖苷酶水解牛乳中的乳糖以满足乳糖不适症患者的需要，是较为实用、有效的方法。 采用给患者同时服用 乳制品和 β半乳糖苷酶片 (通常是霉菌 β半乳糖苷酶 ，它的最适 pH 值与胃环境相一致 )，也可以解决这一问题。 提高乳制品的甜度 乳糖的甜度较低，只有蔗糖 的 20％，水解后，一分子乳糖 生成一分子葡萄糖和一分子半乳糖，可以明显提高乳制品的甜度，减少甜味剂的用量，而且不增加食品的热量 [8]。 防止乳制品冷冻时出现结晶 乳糖的溶解度较低，只有蔗糖的 10％，在制作冷冻乳制品时容易结晶析出，影响产品质量。 若在加工中添加 25~30％的乳糖水解乳，可防止这类质量问题的东北电力大学学士毕业论文 6 出现 [9]。 在酸乳制作中的应用 用 β半乳 糖酶水解乳制作酸乳比使用普通脱脂乳省时且节省蔗糖用量，而且能改善酸乳风味和口感，延长酸乳的货价期。 在乳清加工中的应用 乳清中含有乳清蛋白、乳糖、 矿物质和维生素等营养成分，其中乳清蛋白是完全蛋白质。 世界年产量约为 9107T，其中 50％当废水排放，不仅造成浪费，而且污染环境。 用 β半 乳糖苷酶将乳清中的乳糖水解，可以提高含乳清饲料的营养价值，同时去除了乳清浓缩时乳糖结晶析出给饲料加工带来的不便。 此外，用此水解物还可生产乳清饮料、糖浆、食品添加剂等 [10]。 在乳味面包中的应用 在乳味面包制作中，添加 β半乳糖苷酶 水解乳，能够增加面包甜度，提高酵母菌产气量，使面包更加膨胀，而且水解乳中的半乳糖有利于褐变，改善面包色泽。 生产低 聚半乳糖 (Galactooligosaccharide) 低聚半乳糖是以牛乳或乳清中的乳糖为底物，经 β半乳糖苷酶催化作用而得到的。 低聚半乳糖的热稳定性较好，即使在酸性条件下也是如此，并且具有许多生理功能，如作为双歧杆菌增殖因子；能促进钙质吸收和防止骨质减少；有利于促进有机酸生成，降低肠道 pH 值，抑制外源菌的生长代谢；有利于 B 族维生素产生；低能量；低致龋齿性；改善脂质代谢等 [11]。 分析食品中乳糖含量 将精制的 β半乳糖苷酶和其它酶 (如过氧化物酶、葡萄糖氧化酶 )联合使用可以分析冰淇淋、干酪和含 牛乳的干制品中的乳糖含量。 该法简便快捷，费用低廉，第 1 章 绪 论 7 又可以在样品不除去蛋白的情况下使用，适合于在食品工业上进行应用 [12]。 β半乳糖苷酶在制药工业中的应用 β半乳糖苷酶是酶类药物，适用于婴儿各种消化不良症，如先天性乳糖酶缺乏症、由胃障碍及缺铁所致的幼儿慢性腹泻、幼儿及新生儿腹泻，由感冒及消化不良等引起的继发性腹泻。 加入牛乳中则可防止由牛乳中乳糖不能吸收而引起的乳糖不耐症。 β半乳糖苷酶在酶联免疫反应 (EIA)中的应用 β半乳糖苷酶经戊二醛一步标记抗人 IgG，建立了 ELISA 测 定程序，已用于人 IgG、人群破伤风抗体、单克隆抗体检测，获得满意结果。 同时用于孕酮、皮质醇半抗原标记，初步建立了该酶的液相竞争测定程序。 近年来，又报道了合成该酶的大分子底物，因此， β半乳糖苷酶不仅可用作超微量荧光酶联分析，而且还可以在酶放大免疫测定（ EMIT）和底物标记荧光分析中进行应用（ SLFIA）[13]。 第 2 章 材料和方法 8 第 2 章 材料和方法 材料 材料与试剂 菌种来源：春光乳制品厂附近采集的土壤 邻硝基苯 βD半乳吡喃糖苷 （ ONPG）分析纯 邻硝基苯酚（ ONP） 分析纯 5溴 4氯 3吲 哚 βD半乳糖苷（ Xgal）分析纯 二甲基甲酰胺（ DMF）分析纯 蛋白胨、乳糖、琼脂、酵母粉、 NaCl 均为分析纯 仪器与设备 752 型紫 外 /可见分光光度计 北京光学仪器厂 HQZF 全温振荡培养箱 哈尔滨东联电子技术开发有限公司 LRH250II 生化培养箱 广州医疗设备厂 PB10 pH 计 Sartorius 0． 20 u m 无菌滤器 Sartorius zC10 恒温水浴槽 宁波天恒仪器厂 培养基 分离选择培养基：蛋白胨 2%，琼脂 2%， Xgal 20mg/ml，酵 母粉 %，乳糖 2%，%，蒸馏水 100ml， ~,121℃ 高压蒸汽灭菌 15~30min。 液体发酵培养基：蛋白胨 2%，酵母粉 %，乳糖 2%， %，蒸馏水 200ml，pH 自然。 东北电力大学学士毕业论文 9 产 β半乳糖苷酶菌的筛选 菌株筛选方法 取土样，稀释 10 倍，置于 80℃ 水浴锅中加热 30min，以去除不产芽孢的菌体。 摇床振荡，使土壤颗粒被打散，混合均匀，用无菌水将上述溶液稀释成 1010 10 106梯度，各取 200μL均匀涂布于乳糖筛选平板上， 35～ 40℃ 培养20～ 28 小时。 分离纯化 培养后，挑取 不同形态的 蓝色菌落，通过平板划线进行分离纯化，重复三次；对分离菌株进行培养形态观察和镜检，确定纯培养。 菌种生理生化鉴定 在细菌形态学鉴定的基础上，对所筛菌株进行初步的生理生化鉴定。 β半乳糖苷酶粗酶液制备 将纯化菌株按体积分数为 1％的接种量接种于液体发酵培养基中， 37℃ 静置培养 24h。 将培养好的菌液以 5000r/min 离心 10 min，弃掉上清液．沉淀经预冷的磷酸缓冲盐溶液洗涤后，在冰浴中进行超声波破碎。 裂解后的菌液 在 4℃ 下以12020r/min 离心 10min，收集上清液，即为粗酶液。 邻硝基苯酚（ ONP）标准曲线 用柠檬酸 Na2HPO4 缓冲溶液 ()配制 5mmol/ml 邻硝基苯酚（ ONP）。 取 7 支试管分别吸取 0， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， ， 5mmol/ml ONP，补上述缓冲液至 ，然后 40℃ 保温 15min，加入 2mL ， 1mol/LNaCO3，以第一管为空白，于 420nm 测 定吸光度，以 ONP 的量为横坐标，以 A420 为纵坐标绘制标准曲线。 第 2 章 材料和方法 10 β半乳糖苷酶酶活力测定 取 粗酶液与 浓度为 mol/L 邻硝基苯 βD半乳吡喃糖苷(ONPG)的 0． 05 mol/L 磷酸钠缓冲液 (pH 值为 6． 5)混匀， 37 ℃ 反应 10 min 后，加入 mL 浓度为 mol/L 的 Na2CO3终止液静置 5 min，于 420 nm 比色测定生成邻硝基苯酚 (ONP)浓度。 1 个酶活性单位 (u)定义为在 37℃ 下每分钟分解出1μmol ONP 所需的酶量。 β半乳糖苷酶酶学性质 菌种生长曲线测定 在筛选平板上挑一单菌落接种于装液量 30 mL培养基的 250 mL三角瓶中，37℃ 、 225r/min恒温摇床培养，分别于 0、 1 1 2 3 4 60h取样。 每个处理重复 3次。 以未接种的基础培养液为空白对照。 测定菌液的吸光度 OD595 (即生物量 )。 以培养时间为横坐标； OD595为纵坐标绘制生长物线。 培养时间对菌株产酶能力的影响 将种子菌液以 2％的比例接种到装有 30 mL基 础培养基的 250 mL三角瓶中．在 37℃ 、 225 r/min的条件下培养，分别于 0、 1 1 2 3 4 60 h取样，每个处理重复 3次，测定生物量和 酶活性并绘制曲线。 接种量对菌株 BGJ222 产酶能力的影响 将种子菌液以 、 、 、 、 、 、 、 、 、 ％的比例接种到装有 30 mL 基础培养基的 250 mL 的三角瓶中，于 37 ℃ 、 225 r/min 恒温摇床培养 24 h 取样测定 β半乳糖苷酶表达量，每个处理重复 3 次。 pH 值对 β半乳糖苷酶活力和稳定性的影响 测定 β半乳糖苷酶粗酶液在不同 pH 值的浓度为 力，确定 pH 值对 β半乳糖苷酶活力的影响。 缓冲液分别为醋酸钠 (pH 值为 ，东北电力大学学士毕业论文 11 ， )、磷酸钠 (pH 值为 ， ， 和 )和 Tris—HCl(pH 值为 ， 和 )，相对酶活用百分比来表示。 将 β半乳糖苷酶在上述缓冲液中 37℃ 保温 2 h 和 24h 后，测残留的酶活力，分析 pH 值对 β半乳糖苷酶稳定性的影响。 温度对 β半乳糖苷酶活力和。