mir-430基因簇的生物信息学分析毕业设计论文(编辑修改稿)

mir-430基因簇的生物信息学分析毕业设计论文(编辑修改稿)内容摘要：

RNA 数量众多，为防止混淆，除最早发现的 lin4， let7 及 lsy6之外，研究者们对于其他 miRNA 统一用 miR(为数字 )表示，其基因则记为mir(为相应数字 )。 高度同源的 miRNA 在其后加英文字母加以区别，多拷贝miRNA 基因再其后再加数字。 （ 1） 除了 lin4 和 let7 外，其他 miRNA 统一用 miR(为数字 )表示， mir(代表数字 )表示相应的编码基因。 （ 2） 高度同源的 miRNA 在 后加英文小写字母 (般从 a 开始 )。 （ 3） 多基因拷贝的在后面加 No(如 miR2aI)。 之后人们又对命名规则作了补充。 不同物种中同源的 miRNA 最好用同一个名字；如果一个前体的两条臂上分别产生一个 miRNA，则根据克隆实验，观察成熟产物，次要的在后面加 “*”号，如果蝇的 miR306 与 miR306*(*表示量少的 )：如果不能区分表达量的多少，可以如下表达：如拟南芥的 miR8355p 和南京邮电大学 2020 届本科生毕业设计（论文） 4 miR8353p(5p 表示在 5’端的臂上， 3p 表示在 3’端的臂上 )。 miRNA 相关功能 首先， miRNA 的生成过程起始于 primiRNA 的产生 ,，它由细胞核内编码miRNA 的基因转录生成，长度为几百到几千个核苷酸。 Lee 等 人证明其中一大类 miRNA 由多聚酶Ⅱ (PolⅡ )转录 ,，而且一些 miRNA 的转录本 (如 let7)具有5′帽和 3′poly(A)的结构。 Rodriguez 等 在基因组水平对 miRNA 的转录也进行了分析，哺乳动物中由内含子编码的 miRNA，其转录酶应该是 PolⅡ。 其次 , primiRNA 在核内被 RNase Ⅲ 核酸酶 Drosha 加工成长约 70nt 的发夹状的premiRNA。 在这个过程中 , Drosha 和另外的一些成分 (如人类中的 DGCR8蛋白、果蝇中的 Pasha 蛋白 )构成一个微小 RNA 处理器 (microprocessor)的复合体， primiRNA 在这个 microprocessor 中被加工成 premiRNA。 最后 , premiRNA 在RanGTP 依赖的核质 /细胞质转运蛋白 exportin5 的作用下，从核内运输到胞质中。 能与 exportin5 结合的 premiRNA 必须具有大于 16nt 配对的茎和 3′末端有 2 个悬垂碱基的结构特点。 胞质中 premiRNA 在 Dicer 酶的作用下，被切割成双链的 miRNA∶ miRNA*配对分子，然后成熟的 miRNA 分子被解链， 单链的miRNA进入一个核糖蛋白复合体 miRNP(也叫 RISC), 通过与靶基因的 3′UTR 区互补配对 , 指导 miRNP 复合体对靶基因 mRNA 进行切割或者翻译抑制。 MiRNA 到底是抑制还是切割取决于 miRNA 与靶序列互补配对的程度，互补配对高的可能进行切割，而配对低的就只是抑制。 近年来 ， 关于 miRNA 的研究已经从识别 miRNA、阐明其作用机制，转移到鉴定其功能。 并且，随着生物信息学的预测方法、原位杂交、过量表达、基因沉默技术等的发展 , 一些 miRNA 的功能已经得到确认。 这些 miRNA 的作用遍及生命体的发生、生长、发育、分化、信号转导、疾病和死亡的过程。 miRNA 对动物发育的调控作用 通过 DNA 芯片技术， Krichevskv 等 [4]在 2020 年证明了在哺乳动物脑发育阶段 miRNA 表达的精确调控，约有 20％的 miRNA 的表达发生了显著变化，其中miR． 19 和 miR． 131 表达失调时，无早衰素的老鼠表现出严重的大脑缺陷；随后相继发现， miRNA 在调控线虫神经系统发育过程中发挥重要作用；美国哈佛医学院的研究人员研究发现， miRNA 通过转录后抑制 HOX 基因表达，在脊椎动物发育过程中发挥重要作用；美国华盛顿大学的研究人员证明在干细胞不断分裂的过程中 miRNA 是必要的条件； Bruneau[5]发现 了 miRNA 是心脏形成过程的一个靶标，同年，美国西北大学和卡耐基梅隆大学的研究人员合作研究发现，南京邮电大学 2020 届本科生毕业设计（论文） 5 miRNA 在调节卵生长过程中起到重要的作用。 在肌肉发育方面， Alex Clop 等 [6]证实， Texel 绵羊中的 GDF8 基因的 339。 UTR 内的一个点突变产生了一个可以在骨骼肌内高度表达的两个 miRNA，即 miR1 和 miR206，它们同时作用的靶位点，从而引起 miRNA 介导的 myostain 浓度在转录后降低而造成肌肉造成肌肉肥大；Chen 等证实， miR1 通过作用于 HDAC4 而促成肌细胞分化为成熟的肌肉细胞，抑制细胞扩增， miR133 则通过抑制 SRF 而促进成肌细胞扩增，抑制其分化。 miRNA 对动物疾病发生的影响 研究表明， miRNA 与人类的肿瘤形成、癌症发生密切相关。 Michael 等 [7]发现在人类直肠瘤形成过程中， miR143 和 miR145 表达量保持较低水平： Van denBerg A等用 SAGE技术研究发现，霍奇金淋巴瘤中 miR155／ BIC高度表达 (达91％ )，作为对照，其在非霍奇金淋巴瘤中几乎不表达；随后 Calin 等 [8]发现，在超过 68％的慢性淋巴细胞白血病例中， miR15a 与 miR． 16a 水平双双下调；Takamizawa 等 [9]发现肺癌病人的 let7 表达显著降低；还有研究表明：淋巴瘤中，miRNA 的一类 miRl792 可能是潜在的致癌基因，并且发现一种叫做 eMyc 的转录因子能调节 miRNA； 2020 年，美国俄亥俄州立大学的 Volinia 等 [10]通过分析来自肺部、胸部、胃部、前列腺、结肠和胰腺等处的癌细胞样品 540 份，发现了有过量表达的部分 miRNA 组成的实体癌症 miRNA 信号，在这些 miRNA 中包括miR175p、 miR20a、 miR2 miR9 miR106a 和 miR155。 这说明 miRNA在实体肿瘤的癌症发病机理中发挥着重要的作用。 miRNA 对动物细胞增殖和凋亡的影响 Hipfner 等 [11]在果蝇体内鉴定出第一个与增殖相关的 miRNA 基因 Bantam 及其靶基因 hid。 Bantam 与 hid miRNA 的 339。 UTR 互补结合，阻止了 hid miRNA 的翻译，抑制蛋白的表达，最终表现为促进细胞增殖的作用；随后， Xu 等在果蝇体内发现了另一种凋亡抑制 miRNAmiR． 14。 miR14 的缺失促进了 Reaper 以来的细胞凋亡的发生，尽管果蝇仍能存活，但对压力反应过敏，生存期缩短；耶鲁大学分子发育生物学和细胞发育生物学系还证实了 miRNA 对衰老和死亡的调控作用， miRNA 可以阻止细胞过早死亡。 动物 miRNA 的负调控功能不仅局限于抑制靶基因转录， Brennecke 等利用人工构建的与 Bantam 完全互补的靶基因，证实 了动物 miRNA 一样可以引起靶基因的降解。 还有研究发现， miR196 基因和靶基因 Hoxb8 匹配得非常完美，导致靶基因 mRNA 的降解，从而达到调控作用。 而植物中的 miRNA 几乎都引起靶基因降解，这是植物 miRNA 和动物 miRNA的一个重要的区别。 植物 miRNA 同靶基因配对完美，而且它们的互补位点可以南京邮电大学 2020 届本科生毕业设计（论文） 6 位于靶基因转录区域，而不是限制在 339。 UTR。 在研究拟南芥花发育过程中发现的miR． 172 是作为转录抑制基因出现，它同靶基因 APETALA2(AP2)的互补位点却位于编码区域，而非 339。 UTR。 miRNA 鉴定方法 迄今发现的 miRNA 主要通过两种途径获得，即构建富集 miRNA 的 cDNA 文库和生物信息学方法。 （ 1） cDNA 文库法 该方法是首先从细胞组织中提取总 RNA，用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行大小分级，回收大小在 20~25 个核苷酸的 RNA 分子，利用 T4 连接酶，直接将人工合成的 5′和 3′接头连接到 RNA 上后，用 PCR 反转录扩增这些序列，获得 miRNAs 的 cDNA 文库，再将这些 cDNA 进行克隆、测序，然后用生物信息学软件对其进行基因组中定位，并验证是否具有发夹结构的前体以及该发夹结构在其它物 种中的保守性，最后将具有发夹结构的小分子 RNA 进行 Northern 杂交等以检测其表达情况，最终将符合 miRNA 标准的小分子 RNA 鉴定为新的 miRNA。 但是，对于部分表达丰度低、且具有组织和阶段表达特异性的 miRNA，以及一些由于自身的物理因素，如序列成份和转录后修饰等，而很难通过克隆的方法得到的miRNA, 通过建文库的方法寻找 miRNA 具有明显的局限性。 除此之外 , 一些内源性的小 RNA 以及 mRNA 和其他非编码 RNA 的降解产物对克隆也具有一定的干扰作用。 （ 2）生物信息学方法 生物信息学方法 是依据在不同的物种中，成熟的 miRNA 具有较大的序列同源，前体的茎环结构具有相当大的保守性，其结构和序列的热力学稳定性与已知miRNA 具有相似性，以及 miRNA 在基因组中往往是成簇排列的这一特征在基因组数据库中搜索新的 miRNA 基因。 第一种方法主要根据保守性来进行预测。 MiRscan 根据候选 miRNA 与已确认的 miRNA 的相似性来识别并分类保守的发夹结构，预测了 35 个 的新候选 miRNA 和 107 个人的新候选 miRNA。 除了 MirScan 以外，根据保守性预测的软件还有 miRseeker。 MiRseeker 不仅仅简单的利用了保守性 , 而且可以识别 miRNA 的特殊的保守类型 , 如较多分叉的茎环序列或者更加保守的发夹茎部。 另一种有效方法是通过研究已知 miRNA 的临近序列来发现 miRNA，因为许多 miRNA 都是成簇排列的或距离很近。 许多人类和小鼠的 miRNA 就是通过这种方法发现的。 南京邮电大学 2020 届本科生毕业设计（论文） 7 近来，实时定量 PCR 也应用于 miRNA 的定量分析。 它的最大优点是高精度定量与高灵敏度。 Bandr233。 s 等 [12]用实时定量 PCR 检测了 16 个结肠癌细胞系与 12 对临床的肿瘤组织 正 常组织的对比样本中 156 个 miRNA 的表达，鉴定出在结肠癌细胞系于临床样本中有 13 个 miRNA 的表达异常。 miRNA 对基因表达的影响 了解造成生物体各种表型差异的分子生物学基础是遗传学的基本问题之一。 在过去的很长一段时间中，分析基因表达谱变化造成的生物体表型改变是分子生物学领域的研究热点。 研究表明，蛋白编码基因的表达在不同细胞、组织及不同的环境状况下具有极大的差异，其表达状况可能受到各种内在因素，如分子伴侣调控，以及其他外在环境因素的影响。 目前 ,随着高通量基因表达技术如基因芯片等方法的发展，对来自不同生物样本的数以万计的基因表达进行测定已经成为生物学常规分析手段，极大地方便了在不同条件下基因的表达状况的检测。 利用全基因组芯片分析方法表明， miRNA 与其靶基因具有复杂的调控关系，可能对全基因组表达状况产生复杂的影响。 miRNA 对靶基因表达的整体调节作用 Lim 等人于 2020 年首次报道了人类 miRNA 对靶基因表达谱的作用，将组织特异性表达的 miRNA,miRl 与 miR124，转导至 hela 细胞内，通过对 hela 细胞转导前后全基因组表 达谱对照分析，发现分别有上百个蛋白编码基因在 miRNA导入 hela 细胞后表达水平呈下降趋势，其中多数基因 3UTR 存在与 miRNASeed区域互补序列，充分说明动物中 miRNA可直接导致靶基因 mRNA表达水平降低。 此外，他们还将 miRNA 靶基因在该 miRNA 特异表达的组织与其他组织中的表达量相比较，发现相对 m1RNA 表达的组织中， miRNA 靶基因表达量较无该miRNA 表达的组织为低。 miRNA 与靶基因表达的关联效应 Sood 等 [12]采用与 Lim 等人类似方法，选取多套人类基因表达谱数据 ，利用PicTa:软件预测 miRNA 靶基因，证实 miRNA 靶基因在 miRNA 特异表达的组织中的表达量低于非表达组织 ,并且发现在某些癌症组织，个别 miRNA 表达异常增高 ,而其靶基因表达量出现相应下降。 南京邮电大学 2020 届本科生毕业设计（论文） 8 miRNA 在小鼠不同发育阶段对靶基因表达谱影响 Farh 等 [13]采用对小鼠 miRNA 靶基因相对表达量进行密度做图的方法，与Lim 等人的方法取得了较为一致的结论，并发现随着小鼠从胚胎期到成年的过渡，某些 miRNA 表达量上升，同时造成靶基因表达量的下降。 说明 miRNA 可能对限定靶基因表达范围，促使器官分化中具有重要意义。 miRNA 对靶基因表达调控的倾向性 Yu 等人 [14]采用与 Lim 与 Sood 等类似的方法，大规模分析 m。