临床医学工程实践实验报告(编辑修改稿)

临床医学工程实践实验报告(编辑修改稿)内容摘要：

息要再三的确认，细胞的种类要写清楚，并且在实验笔记上也应该清楚的记着，以防出现类似的失误。 通过这个实验，我们初步 学习了细胞传代培养的步骤及操作，因为我们组有曾经参加省生物竞赛的同学，对细胞传代培养进行多次操作过，因此，这个实验我们组也较快的完成并掌握了。 【细胞基因组 DNA 提取 】 一、 实验目的 掌握细胞基因组 DNA提取的原理和方法； 学会对实验现象进行分析。 二、 实验仪器及试剂 仪器名称 规格型号 微型离心机 \ WH866 旋涡混合器 \ 冰箱 \ 离心管 高速离心机 Neofuge15R Top Pette Single Channel Pipettor 220ul、 20200ul、 1001000ul 数显式电热恒温水浴锅 纯水仪 Aquelix5 烧杯 50ml、 100ml 实验试剂 PBS Buffer() 10mmol/L TrisCl %SDS 蛋白酶 K（ Protease K 20mg/mL） 5M NaCl CTAB/NaCl 溶液 氯仿 /异戊醇（ 24:1） 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 异丙醇 无水乙醇 TE 缓冲液 DNA提取缓冲液： 10mmol/L TrisCl， ， %SDS 三、 实验过程 细胞 用微型离心机 离心收集， 速率为 3000rpm， 时间为 5min，冷冻保存； 细胞重悬于冰冷的 PBS漂洗，离心去上清，重复 2次； 加入 500ulDNA提取缓冲液混匀； 加入 10ul蛋白酶 K使终浓度达到 50ug/ml 混匀， 50℃水浴 3h； 加入 100ul 5mol/L NaCl, 充分混匀，再加入 80ul CTAB/NaCl溶液，混匀后再65℃ 温育 10min。 加入等体积（约 600 181。 L）氯仿 /异戊醇（ 24:1），充分 混匀， 10,000 rpm离心 5 min。 离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 A）至新的 mL离心管中。 加入等体积酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1）于上清液 A 中，充分混匀 ， 10000 rpm离心 5 min。 离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 B）至新的 离心管中。 加入等体积氯仿 /异戊醇（ 24:1）于上清液 B中，充分混匀， 10,000 rpm离心 5 min。 离心后，转移含有核酸的上清液（水相，即上清液 C）至新的 mL离心管中。 加入 至上 清液 C以沉淀 DNA，上下轻柔颠倒离心管几次，可见白色、黏样沉淀即为 DNA。 常温静置 5~60 min后， 12,000~15,000 rpm常温离心 1530 min。 可见 DNA团集于离心管壁边上。 然后小心去除异丙醇，避免碰到DNA团。 加入 2倍体积 20℃预冷无水乙醇， 常温 12,000~15,000 rpm离心 15~30 min。 小心除去乙醇。 室温敞口放置 10min后， 然后加入 20181。 L TE缓冲液重悬 DNA，可放置 37℃下使 DNA重悬完全。 注意事项： 标本必须新鲜，提取前细胞应保持完整，所用 EP管、吸嘴等器物及 ddH2O、试剂等应先进行高温高压灭菌； 吸收 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 应注意将移液管往下一点去吸取，因为 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 分为上下两层，上层为水； 混合试剂、吸取上清等操作时应尽量避免动作剧烈； 弃异丙醇时动作应该要轻，切记甩干，以免 DNA丢失 四、 实验分析 遇到问题及解决 （ 1） DNA提取缓冲液配置时，各成分含量计算遇到困难，经过老师讲解之后，对各成分的计算有个清晰的理解，可以通过计算各各成分在缓冲液中的溶质含量，在计算在原溶液中的体积含量，得出我们各各成分需要多少； （ 2） 吸 取 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 之前，未对它有个清晰的了解，不知道 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 上下分层，吸取的 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） 一部分是水，一部分是 酚 /氯仿 /异戊醇（ 25:24:1） ； （ 3） 加 2倍体积 20℃预冷无水乙醇 ，不了解无水乙醇的作用，不知道该加入多少无水乙醇。 用无水乙醇沉淀 DNA，这是实验中最常用的沉淀 DNA的方法。 一般实验中，是加 2倍体积的无水乙醇与 DNA相混合，其乙醇的最终含量占 67％左右。 因而也可改用95％乙醇来替代无水乙醇。 最后的沉淀步骤要使用无水乙醇。 一般在室温 下放置 15－ 30分钟即可。 实验心得 通过这。